本发明属于大闸蟹养殖，具体涉及一种大闸蟹养殖用益生饲料的制备方法。
背景技术：
1、大闸蟹在我国水产养殖品种中占据独特的地位，因其肉质鲜嫩、蟹黄营养丰富而广受消费者的喜爱。目前全国河蟹养殖水面超过1000万亩，年产量达80万吨，产值超过800亿元，其衍生出的饲料市场潜力也极具诱惑力。然而，据不完全统计，仅1/4的河蟹是使用优质饲料养出的，大量养殖户仍广泛使用农副产品和冰鲜鱼进行投喂，冰鲜鱼投喂不仅成本高，还存在污染水体、河蟹育肥困难及易感染致病菌等风险，采用更廉价且健康的饲料进行水产养殖是未来发展的必然趋势。
2、益生饲料即微生物发酵饲料，以廉价的农副产品(豆粕、麸皮及玉米等)为主要原料，通过微生物分解代谢作用，水解多糖、蛋白质和脂肪等生物大分子物质，生成有机酸、氨基酸、可溶性蛋白及可溶性多肽等小分子物质，得到营养丰富、适口性好、活菌含量高的生物饲料。当前益生菌饲料广泛用于畜禽养殖行业，极大的提高了畜禽的饲料转化率、体重、甚至关系到肉质等生产性能，有机酸、益生菌及其次级代谢产物等能够有效抑制病原菌，促进肠道菌群平衡，缓解肠道疾病，提升宿主免疫抵抗力，为畜禽的健康养殖提供了重要保障。但是，益生菌在饲料养殖上仍然面临一些问题：
3、1.市售益生菌一般为单一菌种，功能单一，难以有效满足不同养殖对象的营养、健康需求，无法做到对水产病原菌的安全防治；
4、2.益生饲料需要足够的活菌数才能正常发挥功效，而市售益生饲料保质期短(运输和保藏时活菌死亡)、售价贵，无法实现降本增效；
5、3.农副产品原料储存不当等带来的毒素包括玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素及赭曲毒素难以解决，严重威胁大闸蟹的健康养殖；
6、4.目前利用复合益生菌剂与饲料直接复配发酵生产具有抗病效果的饲料鲜有报道。
7、经检索，目前未见有使用贝莱斯芽孢杆菌复合菌剂生产大闸蟹用益生饲料的专利报道。此外，目前报道的大多数为乳酸杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、霉菌以及添加一些益生元，包括蛋白酶、糖苷水解酶等混合发酵。而本发明首次报道了一种通过贝莱斯芽孢杆菌复合菌剂发酵玉米、鱼粉蛋白、豆粕粉、小麦和麸皮等原料生产大闸蟹养殖用益生饲料的新方法，制备得到的益生饲料不仅富含大闸蟹易吸收的营养成分和抗病菌的抗菌脂肽和抗生素，可以提升了大闸蟹的体重、存活率、蟹肉蛋白质含量和抗病性能，降低优质饲料的制备成本，而且还能有效降解原料来源的毒素，保障食品安全，尤其是饲料安全。
技术实现思路
1、发明目的：本发明所要解决的问题是提供一种大闸蟹养殖用益生饲料的制备方法，以提供一种具有高浓度及高生物活性的益生菌、低ph环境的大闸蟹养殖饲料，提升大闸蟹的体重、存活率、蟹肉蛋白质含量和抗病性能，降低大闸蟹肠道疾病的发病率，而且还能有效去除原料中存在的毒素。
2、技术方案：为解决上述问题，本发明采取的技术方案如下：
3、一株贝莱斯芽孢杆菌，所述贝莱斯芽孢杆菌分类命名为贝莱斯芽孢杆菌bacillus.velezensis，菌株名为cq-1，已保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(简称cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为cgmcc no.30281，保藏日期为2024年04月08日。以下内容均以此菌株作为益生饲料的主要发酵菌株。
4、所述贝莱斯芽孢杆菌具有下述性质：
5、1、菌落形态学特征与生理生化特性见表1。
6、表1菌落形态学特征与生理生化特性
7、
8、
9、2、16s rdna序列分析：
10、测得菌株的16s rdna基因的核苷酸序列长度为1396bp，其基因序列如seq id no:1所示。将所测序列从gene bank数据库中使用blast程序进行同源性比较，构建16s rdna全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与贝莱斯芽孢杆菌b.velezensis fzb42达到100％同源性。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是贝莱斯芽孢杆菌。
11、上述贝莱斯芽孢杆菌及其次级代谢产物对多种水产致病菌包括溶藻胶弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、海豚链球菌、嗜水气单胞菌具有显著的抑制作用。
12、上述贝莱斯芽孢杆菌复合菌剂能够有效降解多种饲料来源的毒素，包括米赤霉烯酮、黄曲霉毒素及赭曲毒素；
13、上述贝莱斯芽孢杆菌在制备水产养殖饲料中的应用在本发明的保护范围之内。
14、一种大闸蟹养殖用益生饲料的制备方法，利用含有贝莱斯芽孢杆菌cq-1的复合菌剂制备大闸蟹养殖用益生饲料；所述的含有贝莱斯芽孢杆菌cq-1的复合菌剂包括：贝莱斯芽孢杆菌cq-1、乳酸杆菌、酵母菌；所述乳酸杆菌为植物乳杆菌jylp-326，所述酵母菌为酿酒酵母菌。
15、具体的应用方法为：以玉米、花生粉、豆粕粉、小麦、鱼粉蛋白、麸皮为发酵基质，加入含有贝莱斯芽孢杆菌cq-1的复合菌剂混合均匀，所述复合菌剂与发酵基质的质量比为：1:1～1:5，优选1：3；在室温下发酵3～5天，每隔6～8小时进行翻料处理。
16、本发明所述一种大闸蟹养殖用益生饲料的制备方法，具体包括以下步骤：
17、1.贝莱斯芽孢杆菌扩增培养发酵液制备
18、(1a)培养基配制：
19、(1)斜面培养基成分为：葡萄糖5～10g/l，蛋白胨5～10g/l，酵母粉5～10g/l，氯化钠10～15g/l，琼脂粉15～20g/l，溶剂为水，ph值为7.2～7.5；
20、(2)液体种子培养基为：糖蜜5～10g/l，蛋白胨5～10g/l，磷酸二氢钾8～10g/l，硫酸镁1～3g/l，溶剂为水，ph值7.2～7.5；
21、(3)液体发酵培养基为：糖蜜20～30g/l，蛋白胨10～20g/l，磷酸二氢钾8～10g/l，硫酸镁1～2g/l，溶剂为水，ph值为7.2～7.5；
22、(4)益生饲料发酵培养基：液态复合益生菌剂与发酵基质比例为1:5-1:10(v/m)，ph值5.0～6.0，发酵后最终含水量为50％～60％。
23、其中所述发酵基质包括如下组分：玉米、花生粉、豆粕粉、小麦、鱼粉蛋白、麸皮；所述玉米、花生粉、豆粕粉、小麦、鱼粉蛋白、麸皮的质量比如下：玉米20～30，花生粉10～15，豆粕粉10～15，小麦5～10，鱼粉蛋白25～35，麸皮10～15；优选鱼粉蛋白30，玉米25，花生粉12.5，豆粕粉12.5，麸皮12.5，小麦7.5；
24、所述含有贝莱斯芽孢杆菌cq-1的复合菌剂的制备方法如下：将植物乳杆菌jylp-326、酿酒酵母的干菌按照质量比为(5～10)：1混合，优选植物乳杆菌jylp-326、酿酒酵母的干菌质量比为5：1；再将混合物与贝莱斯芽孢杆菌cq-1的培养液按质量比(1:25)～(1:100)混合，优选1:50；在24～36℃、200～500rpm条件下培养，当od660达到2～3时，停止发酵，得到含有贝莱斯芽孢杆菌cq-1的复合菌剂；
25、所述贝莱斯芽孢杆菌培养液的制备方法如下：将贝莱斯芽孢杆菌cq1接种于发酵培养基中，在24～36℃条件下培养16～24h，当发酵液od660达到1～1.5时，停止发酵，得到贝莱斯芽孢杆菌培养液；
26、最优选的发酵培养基包含如下组分：糖蜜30g/l，蛋白胨10g/l，磷酸氢二钾8g/l，硫酸镁1g/l，利用氨水将发酵液初始ph调至7.5。其中所述微生物菌剂中，贝莱斯芽孢杆菌由种子培养基扩培制得。
27、大闸蟹用益生饲料的制备方法如下：
28、1.菌种活化：
29、将贝莱斯芽孢杆菌b.velezensis cq-1菌种接种于斜面培养基，24～36℃静置培养16～20h，再次挑取单菌落划线到斜面培养基上，24～36℃培养16～20h，得到活化菌种备用；
30、2.种子液制备：
31、取步骤(1)中活化好的菌种，无菌条件下接种3环于种子液的摇瓶中，置于转速为150～200rpm的摇床上，温度为24～36℃培养12～16h，得到发酵种子液；
32、3.发酵培养：
33、将步骤(2)中的种子液在无菌条件下以1％～8％(v/v)的接种量，将种子液接种于发酵培养基中，置于转速为200rpm的发酵罐上，24～36℃培养16～24h；发酵液中微生物含量采用od660(菌液在660nm处的吸光值)表示，当od660达到1～1.5时，停止扩培；
34、4.发酵罐发酵制备贝莱斯芽孢杆菌复合菌剂：
35、将步骤(3)中发酵种子液在无菌条件下以10％～15％(v/v)的接种量，将种子液接种于发酵罐中，装液量为60％～70％，转速为200～500rpm，通气比为1.0～1.2vvm，培养温度为24～36℃，初始ph为7.0～8.0，培养16～24h；
36、为制备贝莱斯芽孢杆菌复合菌剂，当发酵液od660达到1～1.5时，将植物乳杆菌和酿酒酵母按质量比为10:1～5:1混匀后投入发酵液中，混合的固液比为1:25～1:100(w/v)；共培养6～12h，od660达到3，ph在4～5时，即可停止发酵，得到贝莱斯芽孢杆菌复合菌剂；
37、5.复合菌剂发酵生产益生饲料
38、为了利用步骤(4)得到的液态贝莱斯芽孢杆菌复合菌剂生产益生饲料。首先，需要配制益生饲料发酵基质，益生饲料的发酵基质包括鱼粉蛋白、豆粕粉、麸皮、玉米粉，按照比例进行称取拌匀，经过匀浆机充分搅碎混合后，过50～70目筛子后得到益生菌复合菌剂的发酵基质。将发酵基质置于发酵床上进行高温预处理灭菌，待复合菌剂接种；
39、准备好相对无菌的发酵基质后，将步骤(4)中得到的液体贝莱斯芽孢杆菌复合菌剂按照1:5-1:10(v/m)的比例接种至上述获得的发酵基质中，确保发酵基质混合物的湿度在50％～60％，然后在进行室温混合发酵，发酵过程经常翻动并保持通气，发酵3～4天后结束。最后将发酵完成的益生饲料经过充分混合后，即获得大闸蟹养殖用益生饲料。
40、6.益生饲料指标测定：
41、对步骤(5)中发酵结束的益生饲料充分混匀取样，保证至少3次重复，用于分析益生饲料的生理生化指标，包括ph计测定发酵上清液的ph值、稀释涂布法计算饲料中的活菌数、利用蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度、酶联免疫吸附法测定毒素含量以及苯酚硫酸法测定总糖等。经测量，本发明得到益生饲料组分和指标如下：发酵滤液ph在2.5～4.5；益生活菌含量在7×1010～8×1010cfu/ml；粗蛋白含量下降50％～65％，淀粉含量下降60％～70％，玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素及赭曲毒素含量均降低至10ppb以下(远低于国标)，可溶性糖浓度达到140～200g/kg发酵饲料，可溶性总氮含量达到13.2～19.2g/kg发酵饲料。
42、有益效果：
43、本发明首次筛选得到一株贝莱斯芽孢杆菌；以该菌株为主的复合菌剂制备方法操作简单，大大降低菌剂的生产成本，能够以玉米、鱼粉蛋白、花生粉、豆粕粉、小麦和麸皮等廉价原材料为发酵基质生产大闸蟹养殖用益生饲料，得到的益生饲料中不仅包含大量的益生菌、可溶性蛋白、抗菌脂肽、抗生素以及其它易吸收的营养素，2.5～4.5的ph环境有效抑制水产致病菌的繁殖，而且还能有效降解饲料源的毒素；获得的益生饲料可以显著提升大闸蟹的增重、抵抗能力、成活率等多种生产性能，这对于大闸蟹养殖用益生饲料和贝莱斯芽孢杆菌复合菌剂的拓展应用具有重要意义。
1.一株贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌分类命名为贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis，菌株号为cq-1，所述贝莱斯芽孢杆菌b.velezensis保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.30281，保藏日期为2024年04月08日。
2.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌在制备水产养殖饲料中的应用。
3.一种大闸蟹养殖用益生饲料的制备方法，其特征在于，利用含有贝莱斯芽孢杆菌cq-1的复合菌剂制备大闸蟹养殖用益生饲料，所述的贝莱斯芽孢杆菌cq-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.30281，保藏日期为2024年04月08日。
4.根据权利要求3所述的大闸蟹养殖用益生饲料的制备方法，其特征在于，所述的含有贝莱斯芽孢杆菌cq-1的复合菌剂包括：贝莱斯芽孢杆菌cq-1、乳酸杆菌、酵母菌；所述乳酸杆菌为植物乳杆菌jylp-326，所述酵母菌为酿酒酵母菌。
5.根据权利要求3或4所述的大闸蟹养殖用益生饲料的制备方法，其特征在于，以玉米、花生粉、豆粕粉、小麦、鱼粉蛋白、麸皮为发酵基质，加入含有贝莱斯芽孢杆菌cq-1的复合菌剂混合均匀，所述复合菌剂与发酵基质的质量比为：1:(1～5)，在室温下发酵3～5天，每隔6～8小时进行翻料处理。
6.根据权利要求3或4所述的大闸蟹养殖用益生饲料的制备方法，其特征在于，所述含有贝莱斯芽孢杆菌cq-1的复合菌剂的制备方法如下：
7.根据权利要求6所述的大闸蟹养殖用益生饲料的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方如下：糖蜜20～30g/l，蛋白胨10～20g/l，磷酸二氢钾8～10g/l，硫酸镁1～2g/l，溶剂为水，ph值为7.2～7.5。
8.根据权利要求4所述的大闸蟹养殖用益生饲料的制备方法，其特征在于，所述玉米、花生粉、豆粕粉、小麦、鱼粉蛋白、麸皮的质量比如下：
9.权利要求3、4或8任一所述大闸蟹养殖用益生饲料的制备方法制备得到的饲料。
10.权利要求9所述饲料在蟹、虾、鱼养殖中的应用。
