本发明属于生物技术和遗传学领域，具体涉及基于4碱基微卫星、适于非损伤性取样的扭角羚个体识别方法。
背景技术：
1、扭角羚是国家ⅰ级重点保护野生动物，其保护具有重要的生态意义。近年来由于保护努力，种群数量有一定程度的恢复，精确的种群调查是种群保护与管理所必须的。野生动物因为警觉，在野外难以寻见，而且出于保护等原因，通常难以获得血液、肌肉等组织样本，因此粪便、毛发等非损伤性组织样本是野生扭角羚遗传信息获取的主要来源。但粪便、毛发dna含量少，其可能在细菌或者环境作用下随机降解，基因组不同位点对降解dna扩增效果不同，而不稳定扩增可能会导致位点的分型错误、产生错误的鉴定结果。因此，亟需研发出一套能稳定扩增粪便、毛发等非损伤性取样样本dna的微卫星位点，建立野生扭角羚准确的个体识别方法。
技术实现思路
1、本发明针对上述技术问题，提供了一种适于非损伤性取样的扭角羚个体识别方法，可以准确鉴定扭角羚个体，结果精确可靠，重复性强。
2、为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
3、一种适于非损伤性取样的扭角羚个体识别方法，包括以下步骤：
4、a、提取扭角羚个体组织样本dna；
5、b、然后向dna中添加pcr mix、多个微卫星markers专用引物、去离子水配置成pcr反应体系，pcr反应使用pcr仪操作平台；
6、c、通过基因测序分型，得到每个微卫星markers的等位基因；
7、d、将所有等位基因导入cervus3.0.7软件进行个体识别。
8、本发明多个所述微卫星markers专用引物从以下基因序列中选取：
9、njl-4：正向引物5’-tagcctaatctgcttcct-3’
10、反向引物5’-catttaccaaacctccac-3’
11、njl-3：正向引物5’-acataaagtcccagttcc-3’
12、反向引物5’-taaagaggcataaagcac-3’
13、njl-5：正向引物5’-agaaccaccaaacaaacc-3’
14、反向引物5’-ctctacatcacagggaac-3’
15、njl-7：正向引物5’-agagggagaaaggagtaaa-3’
16、反向引物5’-aaatcaggttcaaaggga-3’
17、njl-6：正向引物5’-cttgggttgtgaggatggtt-3’
18、反向引物5’-ggcagaaggcacgcagtt-3’
19、njl-2：正向引物5’-ccaggataggaaaggcagaa-3’
20、反向引物5’-cagcaaagagcacccaag-3’
21、njl-8：正向引物5’-actgaagccctcatacct-3’
22、反向引物5’-caacccactccaatactc-3’
23、njl-11：正向引物5’-caagcagcaacgaagacc-3’
24、反向引物5’-gaggcaaaggattagaggaa-3’
25、njl-10：正向引物5’-agggtattatgggagtgg-3’
26、反向引物5’-ggtcttcaaagggatgtg-3’
27、njl-1：正向引物5’-gctggcagagcaggaaaa-3’
28、反向引物5’-tggggatggagtcaaagt-3’
29、njl-9：正向引物5’-tccaccagcagatgaatg-3’
30、反向引物5’-ggagaaggaaacggcaat-3’。
31、优选地，所述专用引物根据多态性排序：njl-4、njl-3、njl-5、njl-7、njl-6、njl-2、njl-8、njl-11、njl-10、njl-1、njl-9，至少选取前6个引物用于个体识别。
32、本发明所述的d步骤，用cervus3.0.7软件根据微卫星位点的分型数据进行个体识别；当两个或两个以上的样品微卫星标记分型结果完全一致时，判定样品来自同一个体；当两个样品的微卫星标记分型结果中有两个及以上标记分型结果不同时，判定样品来自不同个体。
33、本发明所述组织样本dna取自粪便、毛发、肌肉或者肝脏。
34、本发明的有益效果在于：
35、1、本发明的鉴定方法是依据筛选的适于粪便、毛发dna扩增的markers基因序列，设计最优引物，通过基因分型，不同微卫星位点组合的等位基因差异识别扭角羚不同个体。
36、2、本发明采用dna序列作为分子标记，能在粪便等非损伤性取样样本dna中稳定扩增，可以准确鉴定扭角羚个体，结果精确可靠，重复性强，实验快捷，操作简便，技术成熟。
37、3、微卫星的个体识别能够精确地进行野生动物的种群调查，相较于二碱基微卫星，四碱基微卫星不易产生滑带，分型稳定性更高。本发明筛选出适于扭角羚粪便dna稳定扩增的11个4碱基的微卫星位点，并基于这些位点建立个体识别体系，能够用于扭角羚个体识别，为扭角羚精确的野外种群调查提供技术支撑。
1.一种适于非损伤性取样的扭角羚个体识别方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述适于非损伤性取样的扭角羚个体识别方法，其特征在于，多个所述微卫星markers专用引物从以下基因序列中选取：
3.根据权利要求3所述适于非损伤性取样的扭角羚个体识别方法，其特征在于，所述专用引物根据多态性排序：njl-4、njl-3、njl-5、njl-7、njl-6、njl-2、njl-8、njl-11、njl-10、njl-1、njl-9，至少选取前6个引物用于个体识别。
4.根据权利要求1所述适于非损伤性取样的扭角羚个体识别方法，其特征在于，所述的d步骤，用cervus3.0.7软件根据微卫星位点的分型数据进行个体识别；当两个或两个以上的样品微卫星标记分型结果完全一致时，判定样品来自同一个体；当两个样品的微卫星标记分型结果中有两个及以上标记分型结果不同时，判定样品来自不同个体。
5.根据权利要求1所述适于非损伤性取样的扭角羚个体识别方法，其特征在于，所述组织样本dna取自粪便、毛发、肌肉或者肝脏。
