本发明属于纳米生物医用材料工程领域，具体涉及一种具有缓释和支撑功能的负载胰岛素立体支架及其制备方法和应用。
背景技术：
1、目前，种植义齿已成为牙列缺损的主流修复方式。种植牙长期的成功率依赖于植体周围足够的软硬组织。然而，由于牙周炎、外伤或根尖周疾病等因素，种植位点区常常存在牙槽骨缺损后骨量不足的现象，直接导致种植体位置不佳等并发症并影响长期成功率，需进行干预治疗。
2、传统方法主要通过将自体骨或骨代用品植入骨缺损区以获得尽可能充足的牙槽骨骨量，为种植体的植入创造条件，例如，现有技术1(kloss f r,offermanns v,et al,comparison of allogeneic and autogenous bone grafts for augmentation ofalveolar ridge defects—a 12-month retrospective radiographic evaluation[j].clinical oral implants research,2018,29(11):1163-1175.)利用自体骨修复牙槽骨的缺损。此类技术方案存在自体骨的供区创伤大的问题，直接导致患者术后疼痛感加强；并且，此类技术方案还存在对医生操作技术要求高的问题。
3、解决上述自体骨修复产生的问题，目前最常用的技术是使用自体骨联合骨代用品修复牙槽骨缺损。例如，现有技术2(aludden h c,mordenfeld a,et al.lateral ridgeaugmentation with bio-oss alone or bio-oss mixed with particulate autogenousbone graft:a systematic review[j].international journal of oral andmaxillofacial surgery,2017,46(8):1030-1038.)公开了一种基于小牛骨的骨替代材料，其基本原理为，bio-oss骨粉其结构和化学成分跟人骨相似，可以联合自体骨使用，成为新骨形成的内部稳定支架，可诱导新骨的形成。目前bio-oss骨粉是全球广泛应用和认可的骨代用品材料，但是，此类技术方案存在的问题主要体现在两方面:
4、1、bio-oss骨粉不能维持成骨所需要的空间；
5、2、由于糖尿病(diabetes mellitus,dm)患者会出现胰岛素抵抗，致胰岛素分泌不足，从而体内长期处于高糖微环境状态，存在炎症反应重、微血管病变以及高血糖破坏成骨-破骨平衡等问题，即dm直接导致患者在使用自体骨联合骨代用品修复牙槽骨缺损时，新骨形成的速度及新生的牙槽骨质量显著低于无dm的患者。
6、针对此类牙槽骨缺损的dm患者，解决方案的基本原理为，通过药物改善患者牙槽骨缺损的局部微环境，促进骨组织再生修复。具体为，对dm患者注射胰岛素，除了存在控制患者血糖的常规效果，还可以获得促进成骨的作用。但是，此类注射胰岛素的方法，由于游离胰岛素的半衰期仅为20-30分钟，导致无法将注射胰岛素的方法应用在促进dm患者成骨再生领域。
7、解决上述游离胰岛素存在半衰期的问题，可以通过包封胰岛素，达到缓释的效果，提高dm患者胰岛素的利用效率。例如，现有技术3(魏雪竺，刘长营，李贝贝等，负载胰岛素plga微球对种植体周围成骨影响的动物研究[j],口腔颌面修复学杂志,2020,21(01):1-4.)通过采用水包油包水(w/o/w)的复乳法制备，具体为，将胰岛素溶解于水性介质水中作为内水相，将plga溶解于二氯甲烷中作为油相，首先，在高速剪切条件下，将油相注入水相中，两相混合乳化形成油包水初乳，然后，在高速搅拌条件下，将初乳加入含有乳化剂聚乙烯醇的外水相中，形成水包油包水(w/o/w)复乳，之后，利用真空干燥箱去除有机溶剂，随着有机溶剂的减少，复乳固化，形成微球，最终，实现胰岛素相对较长时间的持续释放，促进大鼠高糖环境下种植体周围的骨结合。
8、该技术方案存在的技术问题有3方面：
9、1、微球制备技术繁琐；
10、2、所得微球在体外的储存环境下，会缓慢破裂，导致保存成本较高；
11、3、所得微球为颗粒状，即不具备支撑功能，需进一步处理才能行成支架，并且，在制备成支架的过程，同样存在上述微球破裂的问题。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种具有缓释和支撑功能的负载胰岛素立体支架及其制备方法和应用。其基本原理为，以pcl/plga/nha对甘精胰岛素进行包裹，即具有同轴结构，其中，pcl/plga/nha为壳层结构，甘精胰岛素为核层结构，通过静电纺丝技术将其制备成薄膜，再通过发泡获得负载胰岛素的pcl/plga/nha三维立体支架，即具备较好的生物相容性、药物缓释能力，能维持一定的机械强度并维持成骨空间，有利于dm患者骨组织的修复再生的立体支架。
2、为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
3、一种具有缓释和支撑功能的负载胰岛素立体支架，以聚己内脂pcl、聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga和纳米羟基磷灰石nha为原料，制备壳层，以甘精胰岛素ins作为核层，通过同轴静电纺丝形成具有壳核结构的负载胰岛素的pcl/plga/nha纳米纤维膜，简称为ins-pcl/plga/nha-m；再通过发泡获得负载胰岛素的pcl/plga/nha三维立体支架，即具有缓释和支撑功能的负载胰岛素立体支架，简称为ins-pcl/plga/nha-3d；
4、所述ins-pcl/plga/nha-3d具有亲水性和生物相容性；
5、所述pcl/plga/nha-3d的内部微观结构为pcl/plga/nha对甘精胰岛素进行包裹，即具有同轴结构，其中，pcl/plga/nha为壳层结构，甘精胰岛素为核层结构；
6、所述pcl/plga/nha-m的厚度为1mm；所述pcl/plga/nha-3d的厚度为7mm；
7、所述pcl/plga/nha-m为片层结构，片层结构之间的孔径为10-15μm；所述片层结构由纳米纤维组成，所述纳米纤维呈随机排列状态，纳米纤维的直径为300-600nm；
8、所述pcl/plga/nha-3d为片层结构，片层结构之间的孔径为100-150μm，所述片层结构由纳米纤维组成；所述纳米纤维呈随机排列状态，纳米纤维的直径为300-600nm；
9、所述ins-pcl/plga/nha-3d的抗压强度为2.3-2.5mpa。
10、一种具有缓释和支撑功能的负载胰岛素立体支架的制备方法，包括以下步骤：
11、步骤1，负载胰岛素的pcl/plga/nha纳米纤维膜的制备，以聚己内脂pcl、聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga、纳米羟基磷灰石nha、六氟异丙醇和甘精胰岛素ins满足一定质量比，首先，将nha置于六氟异丙醇中，以一定条件进行超声，得到混合物a，然后，将pcl和plga置于混合物a中，以一定条件进行磁力搅拌，得到混合物b，最后，以一定浓度的混合物b作为壳层溶液，ins作为核层溶液进行同轴静电纺丝，之后，在进行真空干燥，即可得到负载胰岛素的pcl/plga/nha纳米纤维膜，简称为ins-pcl/plga/nha-m；
12、所述步骤1中，pcl、plga、nha、六氟异丙醇和甘精胰岛素ins的质量比为17.1：1.9：1：100：33.4；
13、所述步骤1中，超声的条件为，超声时间为20-30min；磁力搅拌的条件为，磁力搅拌时间为24h；干燥的条件为，干燥温度为25℃-30℃，干燥时间为45-48h；
14、所述步骤1中，混合物b的浓度为20％；
15、所述步骤1中，同轴静电纺丝的条件为，混合物b作为壳层溶液进行同轴静电纺丝之前，以超声时间为20-30min进行超声，纺丝电压为15kv，壳层溶液推注速率为0.09mm/min，核层溶液推注速率为0.03mm/min，收集距离为15cm；
16、步骤2，负载胰岛素的pcl/plga/nha三维立体支架的制备，将步骤1所得ins-pcl/plga/nha-m置于一定浓度的硼氢化钠溶液中，以进行发泡，之后，经洗涤、干燥后，即可得到负载胰岛素的pcl/plga/nha三维立体支架，简称为ins-pcl/plga/nha-3d。
17、所述步骤2中，硼氢化钠溶液的浓度为1m；发泡的条件为，发泡时间10min；
18、一种具有缓释和支撑功能的负载胰岛素立体支架，其特征在于：作为骨再生领域的应用时，具有缓释功能，释放天数为28天；
19、所述缓释功能存在3个释放阶段，分别为，
20、第1阶段为第1天，胰岛素释放浓度为345-355mu/ml；
21、第2阶段为第2-7天，胰岛素释放浓度范围为210-235mu/ml；
22、第3阶段为第14-28天，胰岛素释放浓度为390-415mu/ml。
23、本发明技术效果经以下检测可知：
24、ins-pcl/plga/nha-3d经x射线衍射(x-ray diffraction，xrd)测试，同时包含pcl、plga、nha的特征峰，ins-pcl/plga/nha-3d是pcl、plga与nha简单的物理复合。
25、ins-pcl/plga/nha-3d经宏观形貌测试，表面形貌呈现疏松的的层状块体结构，层状结构之间存在连接，整体厚度为7mm。
26、ins-pcl/plga/nha-3d经扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，sem)测试，微观形貌为片层结构，片层结构之间的孔径为100-150μm，纳米纤维呈随机排列状态，纳米纤维的直径为300-600nm。
27、ins-pcl/plga/nha-3d经透射电子显微镜(transmission electro microscope，tem)测试，内部微观结构为pcl/plga/nha对甘精胰岛素进行包裹，即具有同轴结构，ins-pcl/plga/nha-3d为药物缓慢持续释放的有效载体。
28、ins-pcl/plga/nha-3d经接触角测试，接触角为14.4±2.0°，证明ins-pcl/plga/nha-3d具有良好的亲水性。
29、ins-pcl/plga/nha-3d经活死细胞染色测试，几乎不存在死细胞，证明ins-pcl/plga/nha-3d无毒性，即具有生物相容性。
30、ins-pcl/plga/nha-3d经抗压强度测试，抗压强度均值为2.34mpa，证明ins-pcl/plga/nha-3d具有良好的抗压强度。
31、ins-pcl/plga/nha-3d经胰岛素释放实验，存在3个释放阶段，第1阶段为第1天，胰岛素释放浓度为345-355mu/ml；第2阶段为第2-7天，胰岛素释放浓度范围为210-235mu/ml；第3阶段为第14-28天，胰岛素释放浓度为390-415mu/ml，并且连续释放天数为28天。证明ins-pcl/plga/nha-3d具有胰岛素缓释性能。
32、因此，本发明具有以下优点：
33、1、制备方法简单、经济；
34、2、pcl/plga/nha立体支架同时具备胰岛素缓释功能和支撑功能，即实现改善dm患者局部高血糖微环境的同时，创造并维持成骨空间。
1.一种具有缓释和支撑功能的负载胰岛素立体支架，其特征在于：以聚己内脂pcl、聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga和纳米羟基磷灰石nha为原料，制备壳层，以甘精胰岛素ins作为核层，通过同轴静电纺丝形成具有壳核结构的负载胰岛素的pcl/plga/nha纳米纤维膜，简称为ins-pcl/plga/nha-m；再通过发泡获得负载胰岛素的pcl/plga/nha三维立体支架，即具有缓释和支撑功能的负载胰岛素立体支架，简称为ins-pcl/plga/nha-3d；
2.根据权利要求1所述的负载胰岛素立体支架，其特征在于：所述pcl/plga/nha-m的厚度为1mm；所述pcl/plga/nha-3d的厚度为7mm。
3.根据权利要求1所述的负载胰岛素立体支架，其特征在于：所述pcl/plga/nha-m为片层结构，片层结构之间的孔径为10-15μm；所述片层结构由纳米纤维组成，所述纳米纤维呈随机排列状态，纳米纤维的直径为300-600nm；
4.根据权利要求1所述的负载胰岛素立体支架，其特征在于：所述ins-pcl/plga/nha-3d的抗压强度为2.3-2.5mpa。
5.一种具有缓释和支撑功能的负载胰岛素立体支架的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
6.根据权利要求1所述的负载胰岛素立体支架，其特征在于：所述步骤1中，pcl、plga、nha、六氟异丙醇和甘精胰岛素ins的质量比为17.1：1.9：1：100：33.4；
7.根据权利要求1所述的负载胰岛素立体支架，其特征在于：所述步骤1中，同轴静电纺丝的条件为，混合物b作为壳层溶液进行同轴静电纺丝之前，以超声时间为20-30min进行超声，纺丝电压为15kv，壳层溶液推注速率为0.09mm/min，核层溶液推注速率为0.03mm/min，收集距离为15cm；
8.根据权利要求1所述的负载胰岛素立体支架，其特征在于：所述步骤2中，硼氢化钠溶液的浓度为1m；发泡的条件为，发泡时间10min；
9.一种具有缓释和支撑功能的负载胰岛素立体支架，其特征在于：作为骨再生领域的应用时，具有缓释功能，释放天数为28天。
10.根据权利要求1所述的负载胰岛素立体支架，其特征在于：所述缓释功能存在3个释放阶段，分别为，
