本发明属于纳米材料技术和生物，具体涉及一种用双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料人工改良nk细胞的方法及其应用。
背景技术：
1、不受控制的细胞增殖和凋亡细胞的不当存活会导致癌症的形成，这被公认为是世界上对人类生命健康威胁最大的疾病。尽管三种传统的治疗人类癌症的方法(即手术、化疗和放疗)已经使用了50多年，是迄今为止的主要治疗方法，但术后复发/转移的高发生率、使用高强度能量辐射对肿瘤邻近组织造成的损伤、严重的脱靶全身毒性、先天免疫系统的损害等仍然是这些治疗方法面临的重大的安全性问题。基于肿瘤细胞靶向小分子、适配体、肽、抗体和天然靶向细胞，以及过继细胞疗法，如肿瘤浸润淋巴细胞(til)、嵌合抗原受体t细胞(car-t)和嵌合抗原受体自然杀伤细胞(car-nk)等新兴靶向疗法和免疫疗法的出现有效地弥补了传统治疗方式存在的弊端。与传统治疗策略相比，肿瘤靶向治疗具有独特的优势，为癌症患者带来新的希望，并正在获得行业认可。人类自然杀伤(nk)细胞是一组独特的先天性淋巴细胞，具有一定的细胞毒性作用，可以参与机体的免疫反应。激活后，nk细胞可以分泌促炎细胞因子，如ifn-γ，tnf-α和gm-csf，以及趋化因子(例如ccl3，ccl4，ccl5和xcl1)，以将树突状细胞(dc)，t细胞和巨噬细胞募集到肿瘤组织中，并激活它们以增强抗肿瘤免疫反应。nk细胞作为非抗原特异性肿瘤消除先天免疫中独特的效应子，因其特有的识别/杀伤机制和较强的抗肿瘤活性，在肿瘤免疫治疗中具有广阔的应用前景。然而，患者自身nk细胞有限，外源性输入的nk细胞具有肿瘤部位聚集效率低、易被排除的特点，在一定程度上限制了nk细胞在肿瘤免疫治疗中的应用。近年来，随着嵌合抗原受体修饰t细胞(car-t)在肿瘤治疗中的显著成就，研究人员逐渐将目光转向nk细胞，car-nk应运而生。目前的car-nk治疗已经取得了理想的效果，但抗原受体的高价格和复杂的生理环境对靶向抗原的影响仍然限制了car-nk的发展。因此，nk细胞的过继免疫治疗需要一种成本低、操作简便、安全性好的细胞修饰方法进行人工功能化，以发挥长期靶向作用和维持细胞毒性功能。
2、脱氧核糖核酸(dna)由于其优异的生物安全性、可编程性和可修饰性，在生物医学领域得到了广泛的应用。然而，dna分子在复杂生理条件下的低生物稳定性限制了其在体内的应用。尽管在开发无机材料介导的生物稳定核酸纳米结构方面取得了重大进展，复合纳米载体可能会引入不确定的全身毒性(例如，体内积累并难以降解和清除)，从而阻碍其在体内的应用。近年来，完全由dna组成的抗降解核酸纳米材料在癌症的诊断和治疗中得到了迅速发展，成为能避免潜在细胞毒性的很有应用前景的替代材料。核酸适配体是通过指数富集系统进化(selex)获得的寡核苷酸序列(dna或rna)，与抗体相比，核酸适配体具有成本低、易化学修饰和序列可编程等优点，在疾病的诊断和治疗中发挥着重要作用。利用dna核酸技术人工改良nk细胞的策略是规避无机纳米材料天生局限性的很好的替代技术。例如，tan等将核酸适配体组装到nk细胞上，制备具有特异性和高通透性的功能化nk细胞，用于增强实体瘤的免疫治疗，liu等还采用核酸适体组装的人工nk细胞结合其他治疗策略，增强对实体瘤的治疗效果，并证明该方法在癌症治疗中具有良好的应用前景。
3、dna四面体已被证明是一种具有刚性和稳定性的三维dna纳米结构，广泛应用于癌症检测和治疗领域。基于dna四面体固有的结构特征，通过构建钢化骨架，本工作提出了一种y型骨架刚性dna四面体(简称为d-rdt)。d-rdt由12条单链dna探针组装而成，其四个侧面有y形支架，这种结构使得d-rdt比传统的dna四面体更坚硬、空间骨架更大。由于核酸探针的识别能力受到其与靶受体之间取向和距离的调控，利用d-rdt的优势，空间有序的dna组装体的介导有利于提升核酸适配体的活性和可及性。在本工作中，利用d-rdt的超大空间结构、d-rdt在细胞膜表面的空间定向组装、核酸适配体在d-rdt表面组装成的高活性来对自然杀伤细胞(nk-92mi)进行人工改造，改造后的nk-92mi细胞通过组装核酸适配体被赋予一定的细胞靶向能力和免疫检查点阻断能力，可实现体内病变部位自然杀伤细胞的聚集。通过改造后的自然杀伤细胞分泌细胞因子和pdl1适配体的免疫检查点阻断作用，有效增强了自然杀伤细胞的免疫治疗效果。人工改造的nk-92mi细胞具有良好的肿瘤抑制作用，有助于进一步促进细胞免疫治疗在肿瘤治疗领域的应用。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种用双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料人工改良nk细胞的方法及其应用。
2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、一种双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料，所述材料由双核酸适配体和y型骨架刚性dna四面体组装而成，所述双核酸适配体包括1条具有癌细胞靶向能力的核酸适配体和1条具有免疫检查点阻断效应的核酸适配体，所述y型骨架刚性dna四面体由单链dna探针ta-1e、ta-2e、ta-3、tb-1、tb-2、tb-3、tc-1、tc-2e、tc-3、td-1、td-2e和td-3通过碱基互补配对形成；所述单链dna探针ta-1e、ta-2e、tc-2e和td-2e具有粘性末端，所述粘性末端的长度为15个碱基；所述双核酸适配体可通过单链dna探针ta-1e的粘性末端修饰到y型骨架刚性dna四面体上；所述y型骨架刚性dna四面体可通过单链dna探针ta-2e、tc-2e和td-2e的粘性末端组装到nk细胞表面；
4、所述单链dna探针的序列如下所示：
5、
6、下划线标注的部分为粘性末端。
7、上述一种双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料的制备方法，步骤如下：s1：将摩尔比为1：1：1的单链dna探针ta-1e、ta-2e和ta-3混合，90℃退火5min，然后缓慢冷却至室温，获得ta元件；将摩尔比为1：1：1的单链dna探针tb-1、tb-2和tb-3混合，90℃退火5min，然后缓慢冷却至室温，获得tb元件；将摩尔比为1：1：1的单链dna探针tc-1、tc-2e和tc-3混合，90℃退火5min，然后缓慢冷却至室温，获得tc元件；将摩尔比为1：1的单链dna探针td-2e和td-3混合，90℃退火5min，然后缓慢冷却至室温，加入与dna探针td-2e等摩尔量的dna探针td-1，室温孵育1h，获得td元件；
8、s2：将ta元件、tb元件、tc元件和td元件混合，控制ta元件：tb元件：tc元件：td元件的摩尔比为1：1：1：1，室温孵育1h，获得y型骨架刚性dna四面体；
9、s3：向y型骨架刚性dna四面体中加入具有癌细胞靶向能力的核酸适配体和具有免疫检查点阻断效应的核酸适配体，控制y型骨架刚性dna四面体：具有癌细胞靶向能力的核酸适配体：具有免疫检查点阻断效应的核酸适配体的摩尔比为1：0.5：0.5，37℃孵育1h，获得双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料。
10、进一步的，上述y型骨架刚性dna四面体材料具有4个顶点、6条边和4个具有y型骨架的三角形面，并且在每个顶点处都具有1个向外延伸的粘性末端。
11、进一步的，上述具有癌细胞靶向能力的核酸适配体为sgc8-cta-1e或as1411-cta-1e，上述具有免疫检查点阻断效应的核酸适配体为pdl1-cta-1e；sgc8-cta-1e、as1411-cta-1e、pdl1-cta-1e的序列如下所示：
12、
13、上述一种双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料在人工改良nk细胞中的应用，所述应用为非疾病诊断治疗目的。
14、一种用上述双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料人工改良nk细胞的方法，包括如下步骤：
15、s1：将nk细胞用pbs洗涤重悬后与tcep混合，37℃避光孵育20min，离心，收集细胞沉淀用pbs洗涤重悬，获得经tcep处理后的nk细胞悬液；
16、s2：向经tcep处理后的nk细胞悬液中加入摩尔比为1：1：1的单链dna探针cta-2e-mal、ctc-2e-mal和mal-ctd-2e，37℃避光孵育20min，离心，收集细胞沉淀用pbs洗涤重悬，获得经马来酰亚胺修饰单链dna探针处理的nk细胞悬液；
17、s3：向经马来酰亚胺修饰单链dna探针处理的nk细胞悬液中加入双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料，37℃避光孵育30min，离心，收集细胞沉淀，获得双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料人工改良nk细胞；
18、所述单链dna探针cta-2e-mal、ctc-2e-mal和mal-ctd-2e的序列如下所示：cta-2e-mal：5’-gacatatgctgcctatcttcgattttttttttt-mal-3’，ctc-2e-mal：5’-gcatgctaattggatcggattcttttttttttt-mal-3’，mal-ctd-2e：5’-mal-ttttttttttctctaggcagctggtggtcttga-3’。
19、由上述方法制备得到的双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料人工改良nk细胞。
20、上述的双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料、双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料的制备方法、用双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料人工改良nk细胞的方法、双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料人工改良nk细胞在生物成像中的应用。
21、上述的双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料、双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料的制备方法、用双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料人工改良nk细胞的方法、双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料人工改良nk细胞在制备肿瘤靶向治疗药物中的应用。
22、本发明的发明原理如下：
23、首先，通过dna可编程性和碱基序列互补原则来对单链dna探针进行特殊设计，合成得到每个面均具有“y”型骨架的刚性dna四面体结构(即y型骨架刚性dna四面体)。y型骨架刚性dna四面体的组装示意图见图1a。由于构建的y型骨架刚性dna四面体具有优异的刚性结构性能和超大空间骨架，这一特性使得y型骨架刚性dna四面体顶点装配的核酸适配体分子的活性不会受到影响。因此，y型骨架刚性dna四面体通过面部介导的方式固定在细胞膜表面用于nk细胞空间有序的人工改良，其顶点处装配的双核酸适配体可以各自执行肿瘤细胞靶向和免疫检查点阻断功能。双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料用于空间有序人工改良自然杀伤细胞(da-rdt-nk)的制备及其在恶性肿瘤治疗的应用如图1b所示。本发明的显著优点在于：
24、1)da-rdt材料的rdt骨架具有超大的空间结构和刚性特征，其各个顶点处连接的分子可以各自执行其功能而不受影响。面部介导的安装策略可以有效地将da-rdt材料有序排列在细胞表面，并且能够使得其顶点处装配的核酸适配体具有更好的取向性。
25、2)轻还原修饰的方法是一种生物安全性好、不损伤细胞表面蛋白并且可以自然还原的一种修饰手段，并且可以对不同类型的细胞进行修饰，促进刚性四面体rdt细胞工程化技术的应用。
26、3)da-rdt材料修饰在nk细胞表面，其中rdt的刚性结构及超大的空间骨架可以有效的保护nk细胞的细胞活性，并且可以保护其在递送过程中免受复杂生理环境的影响。
27、4)核酸适配体的特异性靶向功能被进一步引入在人工改良的细胞表面，与之前的单链核酸适配体修饰策略相比，rdt上装载的核酸适配体可以更好地保持其生物活性和稳定性。
28、5)用da-rdt材料改造得到的da-rdt-nk细胞在体外不仅能够靶向肿瘤细胞，而且相对之前研究而言，da-rdt-nk细胞展现出了持续的细胞靶向能力。da-rdt-nk细胞对肿瘤细胞具有很高杀伤能力的主要原因在于da-rdt-nk细胞的高粘附能力和免疫检查点的高效阻断作用。
29、6)da-rdt-nk细胞展现了较好的肿瘤靶向效果，并且从其活体内生物分布情况来看，da-rdt-nk细胞能够在肿瘤位点聚集。
30、7)dna纳米材料的可编程性为其它癌症对应的人工改良自然杀伤细胞提供新思路。该策略只需要更换相对应的靶向核酸适配体即可以针对性改良出用于不同恶性肿瘤的改良性自然杀伤细胞，这一策略可以有效地增强外源性输入的免疫细胞对恶性肿瘤细胞的靶向性，提升免疫治疗的效果。
1.一种双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料，其特征在于：所述材料由双核酸适配体和y型骨架刚性dna四面体组装而成，所述双核酸适配体包括1条具有癌细胞靶向能力的核酸适配体和1条具有免疫检查点阻断效应的核酸适配体，所述y型骨架刚性dna四面体由单链dna探针ta-1e、ta-2e、ta-3、tb-1、tb-2、tb-3、tc-1、tc-2e、tc-3、td-1、td-2e和td-3通过碱基互补配对形成；所述单链dna探针ta-1e、ta-2e、tc-2e和td-2e具有粘性末端，所述粘性末端的长度为15个碱基；所述双核酸适配体可通过单链dna探针ta-1e的粘性末端修饰到y型骨架刚性dna四面体上；所述y型骨架刚性dna四面体可通过单链dna探针ta-2e、tc-2e和td-2e的粘性末端组装到nk细胞表面；
2.如权利要求1所述的双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料的制备方法，其特征在于，步骤如下：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述y型骨架刚性dna四面体材料具有4个顶点、6条边和4个具有y型骨架的三角形面，并且在每个顶点处都具有1个向外延伸的粘性末端。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述具有癌细胞靶向能力的核酸适配体为sgc8-cta-1e或as1411-cta-1e，所述具有免疫检查点阻断效应的核酸适配体为pdl1-cta-1e；sgc8-cta-1e、as1411-cta-1e、pdl1-cta-1e的序列如下所示：
5.如权利要求1所述的双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料在人工改良nk细胞中的应用，其特征在于：所述应用为非疾病诊断治疗目的。
6.一种用权利要求1所述双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料人工改良nk细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：
7.由权利要求6所述的方法制备得到的双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料人工改良nk细胞。
8.权利要求1所述的双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料、权利要求2所述的双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料的制备方法、权利要求6所述的用双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料人工改良nk细胞的方法、权利要求7所述的双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料人工改良nk细胞在生物成像中的应用。
9.权利要求1所述的双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料、权利要求2所述的双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料的制备方法、权利要求6所述的用双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料人工改良nk细胞的方法、权利要求7所述的双核酸适配体修饰y型骨架刚性dna四面体材料人工改良nk细胞在制备肿瘤靶向治疗药物中的应用。
