本发明属于超多重pcr，具体地，涉及一种能够抑制多重pcr非特异性扩增的方法。
背景技术：
1、基于高通量测序的超多重pcr技术(tngs)是一种在病原微生物领域中检测痕量信号的方法。它可以快速抓取靶区域并将信号富集放大、通过高通量测序技术识别信号位点，可以针对性的对下呼吸道、血流、中枢神经感染、人间传染病、公共卫生等多个领域进行治疗策略和干预措施的开发。
2、随着应用的普及和产品开发的不断更新，多重pcr的引物重数逐渐增加，从几重增加到几十重。这种多重pcr通常应用于荧光定量pcr仪。随着下一代测序技术(ngs)的发展，多重pcr的引物重数进一步增加，可以达到几百重、几千重，甚至在一个pcr管中设计超过两万对引物。然而，一管中引物数量的增加一直是该领域发展的最大障碍。尽管primer3.0、primer4.0等多重引物设计算法的提升，使得在一个pcr管中设计混入几百甚至上千对引物成为可能。然而，当引物数量超过1000对时，所有设计者都面临一个无法回避的严峻问题：无论如何运算，都将出现非特异性扩增的问题。这种非目标区域的扩增，会表现的随机且不可控，随着管中引物数的增加和目标基因组的差异，无效数据占比将会指数级上升，严重影响测序成本的同时，增加了不可控测序的异常信号，分析判读将出现很大的风险，因此，抑制非特异性扩增的出现是非常重要的一个需求。
3、目前市面上几乎所有的tngs产品都依赖于引物设计，通过优化设计来尽可能避免非特异性扩增的问题。然而，引物设计是一项复杂的任务，需要考虑包括引物长度、tm值、配对和互补性在内的多个因素，大大增加了实验设计和优化的难度。此外，引物设计可能会受到目标序列的特点的限制，例如序列的保守性和重复序列等。这些限制可能导致pcr反应的灵敏度降低等问题的出现。
4、因此，设计优化引物仍然是tngs产品中一项具有挑战性的任务。研究人员需要综合考虑多个因素，并采取合适的策略来克服引物设计中的限制，以获得高效且可靠的测序结果。简单的优化pcr试剂反应体系来去除非特异扩增的方法，对于某些复杂的样品类型或目标序列不能起到很好的效果。比如，血流感染pgd32的引物组，该引物组多用于纳米孔测序和长片段二代测序平台，选择的片段长度阈值较宽，插入片段多在105bp-375bp之间，扩增子长度在200bp-450bp之间，但常会出现腺病毒c、嗜麦芽窄食单胞菌等非特异扩增信号。
5、因此，需要一种新的抑制超多重pcr过程中非特异性扩增的方法。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种能够抑制多重pcr非特异性扩增的方法，以解决背景技术中提出的问题。
2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
3、一种能够抑制多重pcr非特异性扩增的方法，包括以下步骤：
4、选取引物，随后准备pcr混合物组分，组分包括dna样品、引物、dntp、改良pcr缓冲液、镁盐溶液、热启动酶和超纯水；随后将pcr混合物组分进行多重pcr扩增；
5、其中，改良pcr缓冲液由0.06-0.1mol/l醋酸钠溶液、0.1-0.5mol/l碳酸氢钠溶液和改性tris-hcl缓冲液混合得到的。
6、进一步地，具体包括以下步骤：
7、s1、制备pcr混合物：将由超纯水配置的dntp溶液、改良pcr缓冲液、镁盐溶液和热启动酶溶液在超净环境下混合，制备得到pcr混合物；
8、s2、制备1stpcr反应体系：随后将s1步骤中得到的pcr混合物与引物、dna样品、无核酸酶纯水、改性tris缓冲液混合，得到1stpcr反应体系；
9、s3、pcr扩增：
10、s31、初始变性：将体系在90-100℃下处理5-15分钟；
11、s32、退火与延伸：退火温度95-100℃，时间10-20s；延伸起始温度为60℃，随后进行循环，每次循环升温0.1-0.3℃，循环次数为5-20次，延伸时间为3-7分钟；最后在5-15℃下保持。
12、s4、dna纯化：经离心处理后，使用磁珠纯化dna，出库浓度为2.5-5ng/μl。
13、进一步地，具体包括以下步骤：
14、s1、制备pcr混合物：将由超纯水配置的5-15mmol/l dntp溶液、改良pcr缓冲液、100-200mmol/l镁盐溶液和热启动酶溶液在超净环境下混合，制备得到pcr混合物；
15、s2、制备1stpcr反应体系：随后将s1步骤中得到的pcr混合物与引物、dna样品、无核酸酶纯水、改性tris缓冲液混合，得到1stpcr反应体系；
16、s3、pcr扩增：
17、s31、初始变性：将体系在95℃下处理10分钟；
18、s32、退火与延伸：退火温度98℃，时间15s；延伸起始温度为60℃，随后进行循环，每次循环升温0.1-0.3℃，循环次数为10次，延伸时间为5分钟；最后在10℃下保持。
19、s4、dna纯化：经离心处理后，使用磁珠纯化dna，出库浓度为2.5-5ng/μl。
20、进一步地，s1步骤中，dntp溶液、改良pcr缓冲液、镁盐溶液和热启动酶溶液的体积比为(5-10)：(1-10)：(1-5)：10。
21、进一步地，所述热启动酶为hawkz05 fast聚合酶，浓度为5-15u/μl。
22、进一步地，s1步骤中，改性tris缓冲液由tris缓冲液和te缓冲液混合，随后调节体系ph值为8.5，静置后得到的。
23、进一步地，s1步骤中，改性tris缓冲液由0.5mol/l tris缓冲液和0.01mol/l te缓冲液按照(2-3)：(97-98)的体积比混合，随后使用0.1mol/l氢氧化钠溶液调节体系ph值为8.5，随后静置5分钟后得到的。
24、本发明的有益效果：
25、本发明技术方案中，使用醋酸溶液、碳酸氢钠溶液和改性tris缓冲液制备改性pcr缓冲液，利用改性pcr缓冲液与hawkz05 fast聚合酶的组合用于高通量测序过程中。在引物数量在900以上的情况下，不影响pcr扩增效率的同时，还能有效的抑制pcr过程中大量非特异扩增的出现，优化扩增均一性，提高扩增体系的稳定性。
1.一种能够抑制多重pcr非特异性扩增的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1中所述的一种能够抑制多重pcr非特异性扩增的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
3.根据权利要求1中所述的一种能够抑制多重pcr非特异性扩增的方法，其特征在于，s1步骤中，dntp溶液、改良pcr缓冲液、镁盐溶液和热启动酶溶液的体积比为(5-10)：(1-10)：(1-5)：10。
4.根据权利要求1中所述的一种能够抑制多重pcr非特异性扩增的方法，其特征在于，所述热启动酶为hawkz05 fast聚合酶，浓度为5-15u/μl。
5.根据权利要求1中所述的一种能够抑制多重pcr非特异性扩增的方法，其特征在于，s1步骤中，改性tris缓冲液由tris缓冲液和te缓冲液混合，随后调节体系ph值为8.5，静置后得到的。
