本发明属于细胞工程，具体涉及特异性靶向成纤维细胞的car-m2的制备方法和调控肾纤维化微血管网络再生的应用。
背景技术：
1、慢性肾病(ckd)是增长第四快的死亡原因，影响着世界上超过10％的人口。肾损伤的最后一步是纤维化，其程度与临床结果密不可分，针对上述病症，目前还没有被批准的治疗方法。肾间质纤维化(rif)伴随着成纤维细胞的异常激活和血管的稀薄。肾脏纤维化的形成是一个循序渐进的过程，纤维化生态位的形成伴随着细胞外基质(ecm)的逐渐沉积和扩张，导致病灶的形成，最终引起整个组织和器官的纤维化。纤维化生态位形成与一系列复杂和高度动态的细胞事件相关，包括肾小管细胞损伤、炎症细胞浸润、肌成纤维细胞活化、小管萎缩和微血管稀疏化。成纤维细胞和血管周细胞开始增殖，通过表达平滑肌肌动蛋白(α-sma)获得肌成纤维细胞表型，成为主要的基质产生细胞。成纤维细胞的活化伴随炎症细胞的浸润，如中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞。上述所有的变化都可通过分泌ecm成分、细胞外囊泡、可溶性因子以及代谢产物等方式促进纤维化生态位的形成和纤维化进展。
2、肾纤维化的治疗方式包括药物治疗、手术治疗和干细胞移植治疗，尚无特效的治疗药物或方法能够治愈肾纤维化，目前的临床手段主要通过消除原发病因，减轻病变程度。因此，亟需开发出一种新型的治疗纤维化和促进纤维化后肾脏再生的有效方法。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供特异性靶向成纤维细胞的car-m2的制备方法，克服了尚无特效的治疗药物或方法能够治愈肾纤维化和慢性肾病的技术问题。
2、为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：
3、特异性靶向成纤维细胞的car-m2的制备方法，包括以下依次进行的步骤：
4、s1：构建用于表达氨基酸序列如seq id no:3所示的蛋白的表达载体，然后表达载体通过慢病毒包装，获得慢病毒；
5、s2：使用慢病毒感染前体细胞，经自分泌的il4诱导获得car-m2细胞。
6、进一步，前体细胞为thp-1细胞或者为在骨髓分化的巨噬细胞。
7、进一步，thp-1细胞感染慢病毒后，经弗波酯诱导获得m0巨噬细胞；在自分泌il4作用下，诱导培养获得car-m2细胞；在骨髓分化的巨噬细胞感染慢病毒后，在自分泌il4作用下，诱导培养获得car-m2细胞。
8、本技术方案还提供了根据特异性靶向成纤维细胞的car-m2的制备方法所制备获得的car-m2细胞。
9、本技术方案还提供了一种特异性靶向肾脏成纤维细胞的嵌合抗原受体，其包括抗fap单链抗体、ch8铰链区、cd8α跨膜区、4-1bb和cd3ζ信号传导结构域、胞内il4分泌蛋白；其氨基酸序列如seq id no:3所示。
10、本技术方案还提供了用于表达一种特异性靶向肾脏成纤维细胞的嵌合抗原受体的表达载体。
11、进一步，表达载体由核苷酸序列如seq id no:4所示dna片段整合到慢病毒表达载体上形成。
12、本技术方案还提供了根据car-m2细胞、嵌合抗原受体、表达载体在制备调控肾脏内皮细胞、调控肾脏微血管网络以及促进纤维化后肾脏再生的产品中的应用。
13、本技术方案还提供了根据car-m2细胞、嵌合抗原受体、表达载体在制备调控肾脏内皮细胞、调控肾脏微血管网络以及促进纤维化后肾脏再生的产品中的应用。
14、本技术方案还提供了根据car-m2细胞、嵌合抗原受体、表达载体在研究肾纤维化治疗后对肾脏纤维化、肾脏成纤维细胞和内皮细胞异质性的影响以及作用机制的应用。
15、本技术方案的原理以及有益效果在于：
16、本发明提供了一种特异性靶向和吞噬肾脏纤维化情况下异常活化的成纤维细胞的car-m2细胞(anti-fap-il4-car-m2细胞)，car包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号传导结构域。本方案的car-m2细胞采用的抗原结合结构域为抗fap单链抗体，信号传导结构域具有il4分泌蛋白可以分泌并诱导巨噬细胞m2极化，进而实现了fap靶向和巨噬细胞m2极化的联合。从细胞水平看，导致肾纤维化的原因是活化成纤维细胞，而活化成纤维细胞的表面标志物是成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein，fap)。本发明采用抗fap单链抗体作为嵌合抗原受体的抗原结合结构域，表达所述嵌合抗原受体的m2细胞对活化成纤维细胞具有显著的特异性靶向和清除作用，并且可以通过调控肾脏内皮细胞，促进肾脏微血管网络重建，从而完成肾脏纤维化后肾脏良好再生。从预后角度看，血管稀疏化后的血管网络重建可能是改善肾脏纤维化的重要因素和促进肾脏再生的关键所在。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)技术是指表面表达识别特定抗原并向胞内传递信号的嵌合型受体的免疫细胞，核心是能够识别并且通过免疫细胞杀伤或者吞噬特定抗原细胞。目前，car-t细胞疗法在癌症治疗方面取得了较大进展。鲜有car-m的应用报道，特别是在类似纤维化的非肿瘤性疾病当中的应用。目前的巨噬细胞在体内的表型极化不稳定也是一大问题，信号传导结构域具有il4分泌蛋白可以解决该问题。因此，本方案的car-m2细胞可以调控肾脏免疫微环境，促进肾纤维化微血管网络重建。并通过单细胞测序分析获得car-m2细胞对肾脏纤维化情况下成纤维细胞和内皮细胞的调控机制。本发明拓展了细胞免疫疗法的应用范围，为临床治疗肾纤维化和非肿瘤疾病提供了新思路。
17、综上所述，本方案通过实验验证了fap在肾脏纤维化中上调并与纤维化的发生发展密切相关，且在肾成纤维细胞表面特异表达，定义了肾纤维化的标志分子，并构建了以此为靶点的car-m2细胞，为防治肾纤维化提供有效的方法和药物。验证了car-m2细胞对肾脏纤维化关键表型血管稀疏化的相关内皮细胞的调控，为纤维化后肾脏再生提供新的治疗角度，具有良好的应用前景。
1.特异性靶向成纤维细胞的car-m2的制备方法，其特征在于：包括以下依次进行的步骤：
2.根据权利要求1所述的特异性靶向成纤维细胞的car-m2的制备方法，其特征在于：前体细胞为thp-1细胞或者为在骨髓分化的巨噬细胞。
3.根据权利要求2所述的特异性靶向成纤维细胞的car-m2的制备方法，其特征在于：thp-1细胞感染慢病毒后，经弗波酯诱导获得m0巨噬细胞；在自分泌il4作用下，诱导培养获得car-m2细胞；在骨髓分化的巨噬细胞感染慢病毒后，在自分泌il4作用下，诱导培养获得car-m2细胞。
4.根据权利要求1所述的特异性靶向成纤维细胞的car-m2的制备方法所制备获得的car-m2细胞。
5.一种特异性靶向肾脏成纤维细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，其包括抗fap单链抗体、ch8铰链区、cd8α跨膜区、4-1bb和cd3ζ信号传导结构域、胞内il4分泌蛋白；其氨基酸序列如seq id no:3所示。
6.用于表达权利要求5所述的一种特异性靶向肾脏成纤维细胞的嵌合抗原受体的表达载体。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于：由核苷酸序列如seq id no:4所示dna片段整合到慢病毒表达载体上形成。
8.根据权利要求4所述的car-m2细胞、或者根据权利要求5所述的嵌合抗原受体、或者根据权利要求6所述的表达载体在制备治疗肾脏纤维化或者治疗慢性肾病的产品中的应用。
9.根据权利要求4所述的car-m2细胞、或者根据权利要求5所述的嵌合抗原受体、或者根据权利要求6所述的表达载体在制备调控肾脏内皮细胞、调控肾脏微血管网络以及促进纤维化后肾脏再生的产品中的应用。
10.根据权利要求4所述的car-m2细胞、或者根据权利要求5所述的嵌合抗原受体、或者根据权利要求6所述的表达载体在研究肾纤维化治疗后对肾脏纤维化、肾脏成纤维细胞和内皮细胞异质性的影响以及作用机制的应用。
