本发明涉及生物细胞基因修饰领域，尤其涉及双基因修饰的car-t细胞及其应用。
背景技术：
1、肿瘤/癌症是困扰人类健康和威胁人类生命的重要疾病。人类在与肿瘤/癌症的长期斗争中，已经发展了手术、化疗、靶向治疗、免疫治疗等多种治疗手段，也取得了一定的进步，使得肿瘤/癌症患者的生存几率得到显著提高。但是，目前肿瘤/癌症治疗的水平，仍然于广大患者对健康和生命的期望存在很大的距离。因此，积极发展新型肿瘤/癌症治疗技术仍是医学领域的持续努力的目标。
2、细胞治疗是未来医学的前沿领域和技术高地，免疫细胞car疗法，如car-t细胞治疗技术由于其靶向更精准，杀瘤范围更广、更持久越来越受到人们的重视，虽然其在血液瘤上取得了一定的临床效果。但该技术用于实体肿瘤治疗尚没有获得临床应用上的突破。因此，探索免疫细胞car疗法在实体肿瘤治疗中的应用是当前主要的研究方向。
3、嵌合抗原受体(car)通常是scfv(single-chain variable fragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。通过基因转导的方法转染患者的t细胞，使其嵌合抗原受体(car)靶向肿瘤细胞。cars的胞外段scfv可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起免疫细胞，如t细胞的活化、增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。
4、然而免疫细胞car治疗还存在一些问题，免疫细胞car治疗实体瘤的效果一直都不如血液瘤，其重要的原因之一免疫细胞car疗法中，免疫细胞在实体肿瘤微环境中生存期较短，无法持续对肿瘤细胞进行杀伤。
技术实现思路
1、为了解决上述免疫细胞car疗法在实体肿瘤微环境中的生存期较短的问题，与减少使用慢病毒制备car-t细胞，从而减少工艺误差和降低成本，本发明通过使用crispr-cas9基因编辑技术，通过导入外源基因的方式对免疫细胞的ifn-γ基因和trac基因两处位点进行基因编辑，以提高免疫细胞自身活性与对癌细胞的杀伤效果和减少慢病毒的使用。
2、本发明的技术方案如下：
3、一种双基因修饰的car-t细胞，该car-t细胞的ifn-γ基因和trac基因中分别添加有如seq id no:1和seq id no:2所示核苷酸序列的目的基因。
4、一实施例，所述双基因修饰的car-t细胞中，如seq id no:1和seq id no:2所示核苷酸序列分别是通过crispr-cas9与grna共同构成一种蛋白后添加到ifn-γ基因和trac基因中。
5、一实施例，所述双基因修饰的car-t细胞中，每个所述grna包括grna1和grna2两段核苷酸序列，分别选自如seq id no:21和seq id no:31、seq id no:22和seq id no:32、seq id no:23和seq id no:33、seq id no:24和seq id no:34、seq id no:25和seq idno:35、seq id no:26和seq id no:36、seq id no:27和seq id no:37、seq id no:28和seqid no:38、seq id no:29和seq id no:39及seq id no:30和seq id no:401所示对应核苷酸序列中的任一组。
6、较好地，所述双基因修饰的car-t细胞中，可以通过不使用慢病毒转染的方法成为嵌合抗原受体的上述免疫细胞，其嵌合抗原受体靶向的靶点为cldn18.2、gpc3、her2、taa、gd2、msln、egfr、ny-eso-1、muc1、psma、gucy2c、nectin-4和ebv中的一种或多种靶点。
7、本发明还提供一种微生物系，该微生物系包含上述双基因修饰的car-t细胞。
8、本发明还提供一种生物制剂，该生物制剂包含上述双基因修饰的car-t细胞或者微生物系。
9、本发明还提供上述微生物系、生物制剂及免疫细胞分别在制备预防和/或治疗肿瘤、癌症药物方面的应用。
10、本发明提供的双基因修饰的car-t细胞，通过基因编辑技术将目的基因添加到免疫细胞的ifn-γ基因和trac基因中，具有如下优点：
11、1、在靶细胞的刺激作用下，免疫细胞被靶抗原激活后可诱导表达为car-t细胞并同时分泌il-15；
12、2、免疫细胞在分泌ifn-γ的同时也能分泌il-15，两者互不影响,进而提升了免疫细胞的持续扩增能力和杀伤肿瘤能力，敲除trac基因同时也不影响免疫细胞扩增能力；
13、3、通过crispr-cas9与grna共同构成蛋白的基因编辑技术，可以准确敲除ifn-γ基因和trac基因，并且脱靶效应低。
1.一种双基因修饰的car-t细胞，其特征在于，该car-t细胞的ifn-γ和trac基因中分别插入有如seq id no:1和seq id no:2所示核苷酸序列的目的基因。
2.根据权利要求1所述的双基因修饰的car-t细胞，其特征在于，所述seq id no:1和seq id no:2所示的核苷酸序列分别通过crispr-cas9与不同的grna共同构成蛋白后插入到ifn-γ基因和trac基因中。
3.根据权利要求2所述的双基因修饰的car-t细胞，其特征在于，每个所述grna包括grna1和grna2两段核苷酸序列，分别选自如seq id no:21和seq id no:31、seq id no:22和seq id no:32、seq id no:23和seq id no:33、seq id no:24和seq id no:34、seq idno:25和seq id no:35、seq id no:26和seq id no:36、seq id no:27和seq id no:37、seqid no:28和seq id no:38、seq id no:29和seq id no:39及seq id no:30和seq id no:401所示对应核苷酸序列中的任一组。
4.一种微生物系，其特征在于，所述微生物系包含权利要求1至3任一所述的双基因修饰的car-t细胞。
5.一种生物制剂，其特征在于，该生物制剂包含权利要求1至3任一所述的双基因修饰的car-t细胞，或者包含权利要求4所述的微生物系。
6.权利要求4所述的微生物系在制备预防和/或治疗肿瘤、癌症药物方面的应用。
7.权利要求5所述的生物制剂在制备预防和/或治疗肿瘤、癌症药物方面的应用。
8.权利要求1至3任一所述的免疫细胞在制备预防和/或治疗肿瘤、癌症药物方面的应用。
