本发明属于多肽相关，特别涉及一种紫须红肚海葵多肽毒素md-384及其制备方法和应用。
背景技术：
1、海葵作为刺胞动物门的成员,是现存最古老的有毒动物之一。它们具有丰富的药理和生物技术价值,被称为海洋药物资源库,含有功能多样的肽神经毒素。海洋生物毒素是海洋活性物质研究发展最迅速的领域之一,也是海洋新型药物研究的热点方向。一些海洋生物毒素已经被应用于神经科学研究工具,或直接开发成为新型海洋药物。海葵及其分泌的多肽毒素,为海洋药物研发提供了广阔的潜力和前景。
2、现代药理学研究表明,海葵分泌的毒素具有广泛的生物活性,包括杀虫、降糖、抗肿瘤、抗菌、降压、镇痛和中枢神经抑制等作用。
3、专利cn202311445953.4公开了一种紫点海葵多肽毒素hc-k及其合成方法和应用，其采用dpph清除自由基实验表明海葵多肽毒素hc-k具有良好的抗氧化活性。
4、专利cn202310309321.9公开了一种套膜海葵多肽毒素ed79-wr及其制备方法和应用，其公开的套膜海葵多肽毒素ed79-wr可应用制备杀虫剂。
5、基于前期对紫须红肚海葵转录组数据的分析,从研究较广泛的shk家族中筛选出目标多肽序列,并通过定点氧化法成功合成具有三个二硫键的海葵功能性多肽。通过针对性的镇痛实验,阐明该海葵多肽具有一定的镇痛活性基础。这为开发新型镇痛药物、新型海洋药物奠定了基础,为人类健康和海洋药物研究提供了有价值的支撑。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是提供一种新的紫须红肚海葵多肽毒素md-384，并提供其合成方法和用途。
2、本发明制备的紫须红肚海葵多肽毒素md-384具有镇痛效果，为研发新型、高效、安全生物镇痛药物奠定基础。本发明利用高通量转录组从紫须红肚海葵(macrodactyladoreensis)中发现紫须红肚海葵多肽毒素md-384，具有六个半胱氨酸，形成三个二硫键，其氨基酸序列如下：
3、seq id no:1：avcahffpglcpklarggycrkgrrdrkarfaakycawacggc。
4、本发明通过以下技术方案实现的：
5、一种紫须红肚海葵多肽毒素md-384，具有六个半胱氨酸，形成三个二硫键，其氨基酸序列为avcahffpglcpklarggycrkgrrdrkarfaakycawacggc，二硫键的连接方式为c1-c6，c2-c4，c3-c5，同时使用trt、acm及tbu三种保护基对半胱氨酸进行保护，以确保二硫键的正确连接。
6、紫须红肚海葵多肽毒素md-384的制备方法，包括如下步骤：
7、(1)称取树脂，先用dcm浸泡，然后依次用dmf和dcm洗涤，加入fmoc-ala-oh、dcm和diea进行反应，再加入甲醇和dcm反应，用dmf洗涤，再加入吡啶溶液反应，再用dmf洗涤，得到第一个树脂；
8、(2)在第一个树脂中加入第二个氨基酸fmoc-val-oh和缩合剂，再加入dmf和dic反应，用dmf洗涤，再加入吡啶溶液反应，再用dmf洗涤，得到第二个树脂；
9、(3)根据上述氨基酸序列，重复步骤(2)直到肽链结束，得到线性肽树脂；
10、(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干，加入切割液切割，过滤后，加入冰乙醚，离心后去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；
11、(5)用hplc分离纯化多肽粗品，得到多肽纯品，即纯品线性肽md-384；
12、(6)将步骤(5)的线性肽溶于甲醇-水的混合溶液中，再用乙酸稀释，滴加甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第一个二硫键；
13、(7)再加入等体积盐酸-甲醇溶液，然后加入甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第二个二
14、硫键；
15、(8)用hplc分离纯化后冷冻干燥，得到冻干后的粉末；
16、(9)冻干后的粉末溶于tfa/dmso/苯甲醚溶液中，室温搅拌，再加入tfa/dmso/苯甲醚溶液，在水浴锅中搅拌；
17、(10)加入冰乙醚，离心后去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；
18、(11)用hplc分离纯化、ms鉴定，得到多肽纯品，即氧化肽md-384；
19、进一步的，步骤(1)中，加入0.6～1.0mmol氨基酸fmoc-ala-oh、10～15ml的dcm和1～3ml的diea进行反应80～100min，后再加3～5ml甲醇和8～12mldcm，封闭反应25～35min。
20、进一步的，步骤(1)和步骤(2)中，采用含哌啶质量分数为20％的dmf溶液脱除fmoc，15～25min。
21、进一步的，步骤(2)中，称取1.5～2.0mmol氨基酸fmoc-val-oh和1.5～2.0mmol缩合剂(hobt)，倒入5～15mldmf，再加入1～3mldic反应0.5～1.5h。
22、进一步的，步骤(4)中，切割液为95％tfa、1％h20、2％edt和2％tis，离心为4℃、12000r/min、5min离心3次。
23、进一步的，步骤(5)中，用hplc分离纯化粗品多肽，线性肽md-384的洗脱时间为27.42min，得到纯品多肽，即纯品线性肽md-384。
24、进一步的，步骤(6)中，甲醇-水的混合溶液为50％甲醇/50％水，再用乙酸稀释使肽液最终浓度为每毫升5％甲醇/5％水/90％乙酸的混合溶液中含有肽1mg，甲醇碘溶液为10mg/ml，搅拌1min。
25、进一步的，步骤(7)中，盐酸-甲醇溶液为50mmhcl/50％甲醇，甲醇碘溶液10mg/ml(10-20倍过量)，搅拌1h。
26、进一步的，步骤(8)和步骤(11)中，hplc分离纯化流动相a(h，o)，流动相b(acn)，流速5ml/min，线性梯度洗脱，检测波长220nm。
27、更进一步的，所述梯度洗脱程序如下：
28、
29、进一步的，步骤(9)中，第一次加入的tfa/dmso/苯甲醚溶液为97.9％/2％/0.1％2mg/ml，室温搅拌40min。再按40μl/mg肽加入tfa/dmso/苯甲醚(97.9％/2％/0.1％)溶液，在70℃水浴锅中搅拌3h。
30、进一步的，步骤(10)中，离心为4℃、12000r/min、5min离心3次。
31、进一步的，步骤(11)中，用hplc分离纯化氧化肽，氧化肽md-384的洗脱时间为26.49min，得到纯品多肽，即纯品氧化肽md-384。
32、本发明还提出所述的紫须红肚海葵多肽毒素md-384在制备镇痛药物剂中的应用。进一步的，本发明紫须红肚海葵多肽毒素md-384在制备斑马鱼及小鼠镇痛剂的应用。
33、本发明使用试剂或原料的中文名称如下表1:
34、 试剂 中文名称 dcm 二氯甲烷 diea n，n-二异丙基乙胺 dic n，n’-二异丙基碳二亚胺 tfa 三氟乙酸 edt 1，2-乙二硫醇 tis 三异丙基硅烷 acn 乙腈 dmso 二甲基亚砜 hob t(缩合剂) 1-羟基苯并三唑 fmoc-ala(tbu)-oh n-(9-芴甲氧羰基)-o-叔丁基-l-丙氨酸 fmoc-cys-oh n-(9-芴甲氧羰基)-l-半胱氨酸
35、本发明的有益效果：
36、1、本发明利用高通量转录组从紫须红肚海葵(macrodactyla doreensis)中发现紫须红肚海葵多肽毒素md-384，具有六个半胱氨酸可以形成三个二硫键，其氨基酸序列：avcahffpglcpklarggycrkgrrdrkarfaakycawacggc。
37、2、本发明通过采用多肽固相合成法(spps)合成了线性肽md-384，对线性肽进行hplc纯化，然后利用分步法对合成的线性肽进行氧化折叠，通过二硫键定点氧化后获得含有三个二硫键的氧化肽md-384，二硫键的连接方式为c1-c6，c2-c4，c3-c5，同时使用trt、acm及tbu三种保护基对半胱氨酸进行保护，以确保二硫键的正确连接，并对氧化折叠后的产物进行hplc纯化和质谱鉴定，得到紫须红肚海葵多肽毒素md-384，即氧化肽md-384。
38、3、本发明方法制备的紫须红肚海葵多肽毒素md-384具有镇痛效果，为研发新型、高效、安全的生物镇痛药物奠定基础。
1.紫须红肚海葵多肽毒素md-384，其特征在于，其氨基酸序列为如seq id no:1所示：avc ahffpglcpklarggycrkgrrdrkarfaakycawacggc，具有六个半胱氨酸，，二硫键链接方式为c1-c6，c2-c4，c3-c5，同时使用trt、acm及tbu三种保护基对半胱氨酸进行保护，以确保二硫键的正确连接。
2.紫须红肚海葵多肽毒素md-384的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的紫须红肚海葵多肽毒素md-384的制备方法，其特征在于，步骤(1)反应体系中，所述树脂的取代度sd＝0.2～1.4mmol/g，按比例加入0.6～1.0mmol的fmoc-ala-oh、10～15ml的dcm和1～3ml的diea进行反应80～100min，再加入3～5ml甲醇和8～12ml的d cm反应25～35min。
4.根据权利要求2所述的紫须红肚海葵多肽毒素md-384的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，反应体系中，在步骤(1)得到的第一个树脂中，按比例加入1.5～2.0mmol氨基酸fmoc-val-0h和1.5～2.0mmol的1-羟基苯并三唑，倒入5～15ml的dmf，再加入1～3ml的dic反应0.5～1.5h。
5.根据权利要求2所述的紫须红肚海葵多肽毒素md-384的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，按质量百分比计，所述切割液由95％tfa、1％h20、2％edt和2％tis制得；步骤(4)和步骤(10)中，所述离心条件为于3～5℃、11000～13000r/min离心4～6min，重复离心2～4次。
6.根据权利要求2所述的紫须红肚海葵多肽毒素md-384的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述甲醇-水的混合溶液中甲醇和水的体积比为1:0.8～1.2，所述乙酸与甲醇-水的混合溶液的体积比例为8.5～9.5:1，每毫升乙酸混合溶液中含有肽0.8～1.2mg；所述甲醇碘溶液的浓度为9～11mg/ml，每毫克肽滴加甲醇碘溶液9～11μl，所述搅拌时间为0.5～2min。
7.根据权利要求2所述的紫须红肚海葵多肽毒素md-384的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述盐酸-甲醇溶液由45～55mmhcl和甲醇按照体积比1:0.8～1.2制得；所述甲醇碘溶液的浓度为8～12mg/ml，每毫克肽加入甲醇碘溶液0.15～0.25ml。
8.根据权利要求2所述的紫须红肚海葵多肽毒素md-384的制备方法，其特征在于，步骤(5)、步骤(8)和步骤(11)中，hplc分离纯化流动相a为h20，流动相b为acn，流速4～6ml/min，检测波长220nm。
9.根据权利要求2所述的紫须红肚海葵多肽毒素md-384的制备方法，其特征在于，步骤(9)中，所述tfa-dmso-苯甲醚溶液中tfa、dmso及苯甲醚中体积比为97.8～98.0:1.9～2.1:0.1，室温搅拌前每毫克冻干后的粉末加tfa-dmso-苯甲醚溶液0.4～0.6ml，室温搅拌后加入tfa-d mso-苯甲醚溶液35～45μl，所述室温搅拌的时间为35～45min；所述水浴锅搅拌温度为65～75℃，搅拌时间为2～4h。
10.紫须红肚海葵多肽毒素md-384在制备镇痛药物中的应用。
