本发明属于生物催化领域，具体涉及蔗糖磷酸化酶突变体、编码基因及其在白藜芦醇葡萄糖苷中的应用。
背景技术：
1、白藜芦醇是植物中的天然产物，具有抗氧化、抗菌和抗肿瘤等生物学功能，在治疗和预防疾病等方面具有广泛的应用。然而，该天然产物存在不稳定的酚羟基和水溶解性低等问题，降低了其生物利用度，同时也限制了一些领域的应用，比如较低水溶解性导致其作为药物通过血脑屏障的渗透性差。
2、白藜芦醇的糖基化不仅能有效的提高稳定性，同时具有更好的水溶性。白藜芦醇在水中的溶解度仅为2.6mg/l，且半衰期小于10h。其分子上的三个羟基分别被α-糖基化后，可形成2种α-糖苷产物，包括3-o-α-葡萄糖苷白藜芦醇(3-α-g-res)和4′-o-α-吡哆醇白藜芦醇(4′-α-g-res)。这两种糖苷在水中的溶解度分别提高至51.5mg/l和47.1mg/l，且它们的半衰期至少延长了一倍。此外，白藜芦醇的α-糖苷在体内课被细胞的糖苷酶水解，产生白藜芦醇，表现出与白藜芦醇一致的抗氧化、抗菌以及抗肿瘤等功能。3-α-g-res表现出较高的水溶解性，是白藜芦醇良好的替代品。
3、蔗糖磷酸化酶(spase，ec 2.4.1.7)是糖苷水解酶gh13_18家族的成员，可以催化蔗糖的磷酸解反应生成1-磷酸-α-d-葡萄糖和d-果糖。除此之外，蔗糖磷酸化酶还能对多种化合物进行糖基化反应，即将蔗糖分子中的葡萄糖基转移至受体分子上，合成相应的受体糖苷。若受体分子为水分子时，则实现了蔗糖的水解。蔗糖磷酸化酶具有催化活性高，底物混杂性，糖基供体蔗糖来源广泛且廉价易得等特点。然而，当糖基受体为白藜芦醇时，蔗糖磷酸化酶活性口袋空间偏小，难以实现糖基化修饰。蔗糖磷酸化酶的糖基化活性与其活性口袋入口处的两个柔性loop环密切相关，包括loopa(残基336-344)和loopb(残基132-137)。针对loop环周围氨基酸的突变改造，可扩展其活性空间，使其能够接受白藜芦醇分子作为糖基供体，从而实现了对白藜芦醇糖基化。此外，得益于spase的相对较小的活性催化空间，其糖基化位点的趋向于区域选择性较高，主要产物为3-α-g-res。相比之下，其他一些糖苷水解酶(如环糊精糖基转移酶)往往会存在区域选择性问题，即大量副产物4’-α-g-res产生，极大增加了下游分离纯化的难度。
技术实现思路
1、为了克服白藜芦醇水溶性低、不稳定的问题，本发明经过蔗糖磷酸化酶突变筛选，提供了两种来源的高活性的蔗糖磷酸化酶突变体，及其在催化制备3-α-g-res过程中的应用方法。针对白藜芦醇的糖基化，这些突变体表现出高的催化活性和高的糖基化位点区域选择性，具有良好工业生产的应用价值。
2、第一方面，蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于:所述蔗糖磷酸化酶突变体由bifidobacterium lactis或bifidobacterium adolesc来源的蔗糖磷酸化酶其第135位精氨酸、第344位酪氨酸进行单突变或多点联合突变获得。
3、作为优选，所述点突变为下列之一或其中两种：(1)第135位精氨酸突变为亮氨酸，(2)第344位酪氨酸突变为谷氨酰胺。
4、本发明提供的两种来源的蔗糖磷酸化酶突变体，blaspase是由乳酸双歧杆菌来源的蔗糖磷酸化酶；而badspase是由青春双歧杆菌来源的蔗糖磷酸化酶。
5、本发明提供的bifidobacterium lactis来源的蔗糖磷酸化酶其氨基酸序列如seqid no.1所示；本发明提供的bifidobacterium adolesc来源的蔗糖磷酸化酶其氨基酸序列如seq id no.2所示。
6、作为优选，所述蔗糖磷酸化酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3-8任一所示。
7、第二方面，本发明还提供了编码所述蔗糖磷酸化酶突变体的基因。作为优选，所述blaspase的编码基因核苷酸序列如seq id no.9所示，所述badspase的编码基因核苷酸序列如seq id no.10所示。
8、作为优选，所述蔗糖磷酸化酶突变体的编码基因其核苷酸序列如seq id no.11-16任一所示。
9、第三方面，本发明还提供了含有所述蔗糖磷酸化酶突变体编码基因的重组表达载体。所述重组载体可以用本领域常规方法将本发明的蔗糖磷酸化酶突变体核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，例如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，本发明优选采用表达质粒pet-28a(+)。
10、第四方面，本发明还涉及含有所述编码基因的工程菌。本发明作为一种重组表达载体的应用，可通过将重组表达载体转化至宿主微生物中获得基因工程菌。宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，主要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的蔗糖磷酸化酶突变体基因可以有效表达。本发明优选采用大肠杆菌，更优选为大肠杆菌e.coli bl21(de3)作为表达宿主。
11、第五方面，本发明还提供了所述蔗糖磷酸化酶突变体在酶法制备(e)-白藜芦醇葡糖苷中的应用。
12、具体地，所述(e)-白藜芦醇葡糖苷为(e)-白藜芦醇-3-葡萄糖苷。
13、具体地，本发明具体的所述应用方法包括：以白藜芦醇和蔗糖为底物，加入所述蔗糖磷酸化酶突变体或其重组表达载体，在20～60℃条件下，于ph 4.0～8.0的催化体系中反应，得到含有(e)-白藜芦醇葡萄糖苷催化液。在所述制备方法中，以(e)-白藜芦醇葡萄糖苷和蔗糖为底物，得到对应的催化液，针对白藜芦醇的糖基化，该催化液可得到很好的利用。
14、本发明的有益效果主要体现在：
15、(1)蔗糖磷酸化酶突变体对白藜芦醇糖基化的比酶活是野生型的100～5000倍，且催化合成3-α-g-res的浓度可达到70g/l；
16、(2)底物(e)-白藜芦醇的转化率>95％，而野生型酶的转化率仅为0.02％；
17、(3)合成的糖苷产物中，3-α-g-res纯度＞99％，表现出优良的区域选择性。蔗糖磷酸化酶突变体可以更好地应用于生物催化领域，对3-α-g-res的工业化生产及应用有重要意义。
1.蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于:所述蔗糖磷酸化酶突变体由bifidobacteriumlactis或bifidobacterium adolesc来源的蔗糖磷酸化酶其第135位精氨酸、第344位酪氨酸进行单突变或多点联合突变获得。
2.根据权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于：所述点突变为下列之一或其中两种：(1)第135位精氨酸突变为亮氨酸，(2)第344位酪氨酸突变为谷氨酰胺。
3.根据权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3-8任一所示。
5.编码权利要求1-4任一所述的蔗糖磷酸化酶突变体的基因。
6.如权利要求5所述的蔗糖磷酸化酶突变体的编码基因，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶突变体的编码基因其核苷酸序列如seq id no.11-16任一所示。
7.含有权利要求5或6所述编码基因的重组载体。
8.含有权利要求5或6所述编码基因的基因工程菌。
9.如权利要求1或2或4任一所述的蔗糖磷酸化酶突变体或者如权利要求5或6所述的编码基因在酶法制备(e)-白藜芦醇葡糖苷中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，以含蔗糖磷酸化酶突变体编码基因的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以(e)-白藜芦醇和蔗糖为底物，在20～60℃条件下，于ph 4.0～8.0的催化体系中反应，得到含有(e)-白藜芦醇葡萄糖苷的催化液。
