本发明属于微生物工程，具体地说，涉及用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其用途。
背景技术：
1、1,5-戊二胺的用途相当广泛且在工业生产中具有很高的经济价值，例如可以与二元酸进行聚合反应合成新型尼龙。目前，1,5-戊二胺的生物合成主要利用两种策略进行：发酵生产或体外酶催化。发酵生产1,5-戊二胺是通过赖氨酸脱羧酶(l-lysinedecarboxylase,简称ldc,ec 4.1.1.18)将l-赖氨酸脱去一个羧基而生成。具体的，可以将赖氨酸脱羧酶基因添加至产赖氨酸的微生物例如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中，从而将赖氨酸生物合成途径延长至1,5-戊二胺生物合成途径。目前已有通过dna重组技术改造的具有l-赖氨酸生产能力的棒杆菌属和埃希杆菌属的细菌，其效率的提高是通过过表达l-赖氨酸合成途径的相关基因和反馈抑制脱敏的相关基因，或者强化从葡萄糖代谢开始的能量供应途径而实现的。反馈抑制脱敏的相关基因，例如天冬氨酸激酶ⅲ(lysc)是赖氨酸合成途径中的特异关键酶。然而，由于菌体本身耐受的1,5-戊二胺浓度有限，如果在发酵体系中前期表达了赖氨酸脱羧酶转化生成的1,5-戊二胺过多，就会对菌体造成毒害，从而抑制菌体生长及利用葡萄糖生产l-赖氨酸的过程(qian,et al.,biotechnol.bioeng.2011；108:93–103)。
2、专利申请wo2019006723a1使用嗜热赖氨酸脱羧酶，通过高温控制酶活性，或中国专利cn201510767145.9通过使用温控型启动子表达赖氨酸脱羧酶，一定程度上改善了发酵前期1，5-戊二胺的产生所造成的细胞毒性问题，但使用高温进行催化又额外增加了能耗和生产成本。因此，需要开发更经济、稳定、高效的1,5-戊二胺生产工艺。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种重组dna、包含所述重组dna的基因工程菌，以实现1,5-戊二胺的稳定、高效、低成本生产。
2、本发明的作用机制是，通过将在稳定期特异性启动子控制之下的t7 rna聚合酶基因和在t7启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因重组插入到细菌染色体中，使用稳定期特异性启动子调控t7 rna聚合酶基因表达，所表达的t7 rna聚合酶进一步调控t7启动子，保证l-赖氨酸脱羧酶的足量、稳定表达，大大降低宿主细胞耐受1,5-戊二胺毒害而导致的能耗，从而促进1,5-戊二胺的生产，而整个过程无需使用抗生素、诱导物质等等。可选地，可以进一步结合促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因，例如透过酶(如yebq、mdtd,cgl2893)，以进一步降低胞内1,5-戊二胺浓度，提高1,5-戊二胺的产量。
3、第一方面，提供了重组dna，其包括：
4、a)在稳定期特异性启动子控制之下的t7 rna聚合酶基因；和
5、b)在t7启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因。
6、在一些实施方案中，所述重组dna还包括：
7、c)促进1,5-戊二胺排出的基因，以促进1,5-戊二胺从细胞排出。任选地，所述促进1,5-戊二胺排出细胞的基因在组成型启动子控制之下。
8、在一些实施方案中，所述t7 rna聚合酶基因可以是来源于大肠杆菌例如大肠杆菌(例如bl21(de3)、jm109(de3)菌株)的t7 rna聚合酶基因，噬菌体的t7 rna聚合酶基因或者合成的t7 rna聚合酶基因。
9、在本文中，赖氨酸脱羧酶(简称ldc,ec 4.1.1.18)的基因可以来自微生物、动物或植物的细胞，包括但不局限于大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、嗜碱芽孢杆菌(bacillus halodurans)、天蓝色链霉菌(streptomycescoelicolor)、蜂房哈夫尼菌(hafnia alvei)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)或奥克西托克雷白杆菌(klebsiella oxytoca)等。在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因是来自于大肠杆菌的cada基因或ldcc基因。另外，赖氨酸脱羧酶也可以来自于上述菌株经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。赖氨酸脱羧酶还可以是上述来源的赖氨酸脱羧酶的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段(保留了赖氨酸脱羧酶活性的截短形式的蛋白片段)。
10、在一些实施方案中，所述稳定期特异性启动子选自pcsie、pbola、posmy、pkate、p21、p22、p23或p24中的任意一种；和/或
11、所述t7 rna聚合酶基因可以是来源于大肠杆菌的t7 rna聚合酶基因、噬菌体的t7rna聚合酶基因或者合成的t7 rna聚合酶基因；和/或
12、所述t7启动子是选自来源于噬菌体、pet30a质粒或者合成的t7启动子；和/或
13、所述赖氨酸脱羧酶基因可以选自大肠杆菌的cada基因、ldcc基因、haldc基因、cada基因的片段、ldcc基因的片段或haldc基因的片段。
14、在一些实施方案中，所述促进1,5-戊二胺排出的基因是透过酶基因，例如yebq、mdtd,cgl2893。
15、在一些实施方案中，所述组成型启动子可以是plac、trp、tac或trc启动子。
16、在本文中，“在……启动子控制之下”意指，所述启动子序列和基因序列可操作地连接，从而确保所述基因的转录和表达受到该启动子的控制。
17、在一些实施方案中，pcsie的序列可以是seq id no.1；pbola的序列可以是seq idno.2；posmy的序列可以是seq id no.3；pkate的序列可以是seq id no.4；p21的序列可以是seq id no.5；p22的序列可以是seq id no.6；p23的序列可以是seq id no.7；p24的序列可以是seq id no.8。
18、在一些实施方案中，t7 rna聚合酶基因的序列可以是seq id no.28。
19、在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因的序列可以是cada基因或ldcc基因的序列，例如cada基因的序列可以是seq id no.9，cada蛋白的序列可以是seq id no.10。
20、在一些实施方案中，t7启动子可以是选自来源于噬菌体或者合成的t7启动子，例如t7启动子的序列是seq id no.31。
21、在一些实施方案中，yebq基因的序列可以是seq id no.55，mdtd基因的序列可以是seq id no.56，cgl2893基因的序列可以是seq id no.57或seq id no.13的编码序列。
22、在本文中所使用的组成型启动子是本领域技术人员所熟知的，其可以使促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因在宿主细胞中表达，例如可以使用plac、trp、tac或trc启动子。例如，plac的序列可以是seq id no.60。
23、在一个实例中，提供了重组dna，其包括：
24、a)在稳定期特异性启动子控制之下的t7 rna聚合酶基因，序列选自seq idnos.61、62、63、64、65、66、67或68；
25、b)在t7启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因，序列是seq id no.36；和
26、c)在组成型启动子控制之下的促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因，序列选自seqid nos.69、70或71。
27、本领域技术人员理解，为了提高目的基因在宿主细胞中的表达，可以根据该宿主细胞的密码子偏好对目的基因的编码序列进行优化。例如，可以将目的基因的稀有密码子进行同义替换，使之更接近于宿主细胞的密码子使用方式。通过这种方法，提高外源基因在宿主细胞中表达量的报道已有很多。
28、在本文中，促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因是指，其表达产物促进微生物细胞将1,5-戊二胺排出到细胞外，从而降低胞内1,5-戊二胺浓度及其对胞内赖氨酸脱羧酶活性的抑制，促进1,5-戊二胺的生产。在一些实施方案中，所述促进戊二胺排出的基因包括透过酶的基因。透过酶包括yebq及其同源蛋白，同源蛋白例如包括mdtd、cgl2893等。更具体地，所述促进戊二胺排出的蛋白还可以是上述蛋白的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段。在一些实施方案中，大肠杆菌透过酶yebq、mdtd、cgl2893的氨基酸序列可以是seq id nos.11、12和13，其编码序列可以分别是seq id nos.55、56和57，其中seqid no.57针对大肠杆菌宿主细胞进行了密码子优化。
29、在本文所述的重组dna中，稳定期特异性启动子(元件a)和t7 rna聚合酶蛋白基因(元件b)可操作地连接(表示为a-b)，使得t7 rna聚合酶基因的转录和表达在稳定期特异性启动子的控制之下；t7启动子(元件c)和赖氨酸脱羧酶基因(元件d)可操作地连接(表示为c-d)，使得赖氨酸脱羧酶的转录和表达在t7启动子的控制之下。优选地，所连接的a-b和c-d可以可操作地连接，实现在宿主细胞中表达的t7 rna聚合酶对t7启动子进行调控，进一步通过t7启动子控制l-赖氨酸脱羧酶的生产，提高1,5-戊二胺的产量。
30、在本文所述的重组dna中，组成型启动子(元件e)和促进戊二胺排出的基因(元件f)可操作的连接(表示为e-f)，使得促进戊二胺排出的基因的转录和表达在组成型启动子的控制之下。可选地，前述所连接的a-b、c-d和e-f可以进行可操作的连接或者独立存在。
31、第二方面，提供了含有第一方面所述重组dna的质粒。
32、在本文中，t7 rna聚合酶基因和赖氨酸脱羧酶基因可以包含在同一个质粒中。
33、在本文中，促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因可以包含在与t7 rna聚合酶基因和赖氨酸脱羧酶基因相同的质粒中；或者，其也可以包含在不同的质粒中，独立于宿主染色体而在宿主细胞内表达。
34、第三方面，提供了生产1,5-戊二胺的基因工程菌，其包含第一方面所述的重组dna或者使用第二方面所述的质粒而获得。
35、在本文中，所述基因工程菌的染色体中包含在所述在稳定期特异性启动子控制之下的t7 rna聚合酶基因和在t7启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因。由此，通过使用稳定期特异性启动子调控t7 rna聚合酶基因表达，进一步调控t7启动子控制的l-赖氨酸脱羧酶在稳定期的表达，降低1,5-戊二胺耐受过程中的能耗，促进l-赖氨酸的生产，进而提高1,5-戊二胺的产量。进一步地，所述基因工程菌还可以通过重组在染色体中包含所述促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因或在所转化的表达质粒中包含所述促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因，由此通过表达促进1,5-戊二胺从细胞排出的蛋白而降低胞内1,5-戊二胺浓度及其对胞内赖氨酸脱羧酶活性的抑制，进而提高1,5-戊二胺的产量。本领域技术人员理解，所述重组dna通过基因工程手段整合到所述生产1,5-戊二胺的基因工程菌的染色体上。重组dna插入到出发菌的染色体中，插入位置是生产赖氨酸或1,5-戊二胺所非必须基因的位置，例如upp处。
36、所述基因工程菌的出发菌株可以选自埃希氏菌属(escherichia)、棒杆菌属(corynebacterium)、短杆菌属(brevibacterium)、哈夫尼菌属(hafnia)的菌种，例如大肠杆菌、嗜热菌(thermus.thermophilus)、蜂房哈夫尼菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌。作为出发菌株，可以使用可生产l-赖氨酸的大肠杆菌(escherichia coli)m11a3菌株，该菌株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号cctcc no：m2018456，保藏日期2018年7月6日。
37、在一个实施方案中，生产1,5-戊二胺的基因工程菌在其染色体中包含：
38、a)在稳定期特异性启动子控制之下的t7 rna聚合酶基因，序列选自seq idnos.61、62、63、64、65、66、67或68；
39、b)在t7启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因，序列是seq id no.36；和
40、c)通过重组引入的在组成型启动子控制之下的促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因，序列选自seq id nos.69、70或71。
41、第四方面，提供了生产1,5-戊二胺的方法，包括培养第三方面所述的基因工程菌。
42、在一些实施方案中，培养温度为20-50℃。
43、在本文中，将所述重组dna构建到具有生产l-赖氨酸能力的工程菌中，发酵培养重组菌并进行赖氨酸积累，发酵培养温度控制在20-50℃，进行菌体的快速生长以及赖氨酸积累，进入发酵稳定期后使赖氨酸脱羧酶大量表达，转化生产1,5-戊二胺。
44、如本文所用，术语“约”在用于修改温度范围内的数值时表示该数值与该值的合理偏差，例如，在该范围内所述的值之下或之上1℃或2℃以内，是在所述值或范围的预期含义内。
45、在一些实施方案中，培养在约25℃至约45℃的温度下进行。在其他实施方案中，培养在约30℃至约40℃的温度下进行。在进一步的实施方案中，培养在约35℃至约39℃的温度下进行。
46、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
47、本发明使用了稳定期的启动子，当菌体生长到稳定期后才会启动t7 rna聚合酶基因的表达，进而调控t7启动子下游的赖氨酸脱羧酶基因的表达。与表达嗜热赖氨酸脱羧酶或温控启动子表达赖氨酸脱羧酶相比，本发明可以通过在染色体上插入稳定期特异性启动子-t7 rna聚合酶和t7启动子-赖氨酸脱羧酶，实现赖氨酸脱羧酶稳定和足量的表达，另外，该菌株去除了抗生素、特殊环境条件或其他诱导剂的使用，整个发酵培养过程自调控。
48、将其应用于1,5-戊二胺生产，可以显著降低细胞生长及l-赖氨酸生产阶段产生的1,5-戊二胺的细胞毒性，提高l-赖氨酸产量；发酵结束后，可以将l-赖氨酸几乎全部转化为1,5-戊二胺，从而实现了1,5-戊二胺产量的增加。同时使用了促进戊二胺排出的蛋白，转化的同时将1,5-戊二胺输出胞外，综合显著地提高重组菌株发酵生产1,5-戊二胺的产量，实现了1,5-戊二胺的稳定、高效、低成本生产。
1.重组dna，其包括：
2.如权利要求1所述的重组dna，其中，所述稳定期特异性启动子选自pcsie、pbola、posmy、pkate、p21、p22、p23或p24中的任意一种。
3.如权利要求2所述的重组dna，其中，所述pcsie的序列是seq id no.1，pbola的序列是seq id no.2，posmy的序列是seq id no.3，pkate的序列是seq id no.4，p21的序列是seq id no.5，p22的序列是seq id no.6，p23的序列是seq id no.7，p24的序列是seq idno.8。
4.如权利要求1所述的重组dna，其中，所述t7 rna聚合酶基因选自来源于大肠杆菌的t7 rna聚合酶基因和噬菌体的t7 rna聚合酶基因。
5.如权利要求4所述的重组dna，其中，所述t7 rna聚合酶基因的序列是seq id no.28。
6.如权利要求1所述的重组dna，其中，所述t7启动子选自来源于噬菌体的t7启动子和pet30a质粒的t7启动子。
7.如权利要求6所述的重组dna，其中，t7启动子的序列是seq id no.31。
8.如权利要求1所述的重组dna，其中，所述赖氨酸脱羧酶基因选自大肠杆菌的cada基因、ldcc基因和haldc基因。
9.如权利要求8所述的重组dna，其中，所述cada基因的序列是seq id no.9。
10.如权利要求1所述的重组dna，所述促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因在plac、trp、tac或trc启动子的控制之下。
11.如权利要求1至10中任一项所述的重组dna，其中所述mdtd的基因序列是seq idno.56。
12.如权利要求1至10中任一项所述的重组dna，其包括：
13.含有权利要求1-12任一项所述重组dna的质粒。
14.生产1,5-戊二胺的基因工程菌，其包含权利要求1-12任一项所述的重组dna或者使用权利要求13所述的质粒而获得。
15.根据权利要求14所述的基因工程菌，所述重组dna通过基因工程手段整合到所述生产1,5-戊二胺的基因工程菌的染色体上。
16.如权利要求14所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌的染色体中包含在所述在稳定期特异性启动子控制之下的t7 rna聚合酶基因和在t7启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因。
17.如权利要求14至16中任一项所述的基因工程菌，其中，所述基因工程菌在染色体中包含通过重组引入的所述促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因或在所转化的表达质粒中包含所述促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因。
18.如权利要求17所述的基因工程菌，其来源于埃希氏菌属(escherichia)、棒杆菌属(corynebacterium)、短杆菌属(brevibacterium)、哈夫尼菌属(hafnia)的菌种。
19.如权利要求18所述的基因工程菌，其选自大肠杆菌(escherichia coli)、嗜热菌(thermus.thermophilus)、蜂房哈夫尼菌(hafnia alvei)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)。
20.如权利要求19所述的基因工程菌，其来源于大肠杆菌m11-a3菌株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctcc no：m2018456。
21.如权利要求20所述的基因工程菌，其在染色体中包含：
22.生产1,5-戊二胺的方法，包括培养权利要求14至21中任一项所述的基因工程菌。
