本发明涉及植物分子生物学领域，具体地说，涉及彩色油菜的内参基因及其引物和应用。
背景技术：
1、实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，qrt-pcr)是一种常用的检测基因表达量的方法，因其具有操作简便、高通量、高灵敏度等特点，目前被广泛应用于植物基因表达分析中。qrt-pcr的准确性受rna质量、反转录效率、引物特异性等多种因素影响，因此需要引入合适的内参基因对实验结果进行标准校正，以提高qrt-pcr结果的准确性和可靠性。
2、理想的内参基因应具有相对稳定的表达水平，且不受任何内源性与外源性因素影响，研究中常用表达较高且稳定的看家基因(house-keepinggene)作为内参基因。然而，目前尚未发现能够在不同处理条件下、在所有生长发育阶段和不同组织中均稳定表达的基因。因此，需要根据具体的研究物种、组织类型与实验条件筛选出相适配的内参基因。
3、现有技术中已有相关研究，比如公开号为cn114277033a的专利申请公开了一个中国桔梗rpl13内参基因序列及其引物与应用，该rpl13基因可以作为对中国桔梗以及与其亲缘关系较近的桔梗科其它植物中的类黄酮/花青素合成途径中的色素合成相关基因在中国桔梗及其同科其它植物的蓝、紫、白3种不同花色花器官中进行基因表达水平分析研究的内参基因。也可以作为对中国桔梗及其同科其它植物中的茎、叶及蓝、紫、白3种不同花色花器官共5种不同组织部位中的目标基因进行表达水平分析研究时所用的内参基因。再比如，公开号为cn110628928a的专利申请公开了西南鸢尾花色形成基因表达分析的内参基因及其内参引物与应用，该actin基因可以作为对西南鸢尾以及与西南鸢尾亲缘关系较近的其它鸢尾属植物不同花色变异材料或不同花色品种中类黄酮/花青素合成途径和类胡萝卜素合成途径这2种主要色素合成途径中的色素合成相关基因的表达情况进行研究分析时所用的内参基因。
4、甘蓝型油菜(brassica napus)是一种重要的经济作物，它不仅可以作为食用油和工业油的原料，还具有较高的观赏价值。近年来，通过远缘杂交与定向选择等手段，已经人工培育出具有白色、橙色、粉红色、红色和紫色等花色的彩色油菜。此外，部分彩色油菜还呈现紫色叶片和/或茎秆等特征，也展现了更为丰富多彩的视觉效果。因此，根据甘蓝型油菜公共数据库大量组织样本的转录组测序(rna sequencing，rna-seq)数据，并结合前期已完成的朱红色、玫红色、紫色油菜花瓣组织不同时期的rna-seq数据，筛选出适用于彩色油菜不同组织的色素合成代谢途径相关基因表达分析的内参基因，对于相关基因的功能鉴定、花色和叶色等性状的调控机理研究以及彩色油菜品种的培育都具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种用于彩色油菜花瓣、叶片和茎秆组织中基因表达分析的内参基因及其引物，并提供所述的内参基因ef-1α及其引物在朱红色、玫红色、紫色花色油菜不同发育时期花瓣中花青素代谢相关差异表达基因的qrt-pcr验证中的应用。
2、本发明基于来自甘蓝型油菜公共数据库和朱红色、玫红色、紫色油菜花瓣的转录组测序结果，以油菜参考基因组darmor v4.1的编码序列为模版，利用primer primer5.0和oligo7.0软件并遵循qrt-pcr引物设计的原则，设计出针对8个候选内参基因的引物。随后使用上述引物对3种花色(朱红色、玫红色、紫色)两个发育时期(半开放时期、完全开放时期)的油菜花瓣组织，以及两种颜色(绿色、紫色)的油菜叶片和茎秆组织进行qrt-pcr分析，并利用在线软件reffinder评估所有候选内参基因的稳定性，确定ef-1α基因引物即为所述内参基因引物。
3、具体的，本发明提供了一种彩色油菜的内参基因，所述内参基因用于定量pcr检测彩色油菜不同花色、不同发育时期和/或不同器官组织中基因表达水平，所述内参基因为ef-1α基因，所述ef-1α基因的编码序列如seq id no.1所示。
4、具体的，所述彩色油菜的不同花色为朱红色、玫红色或紫色。
5、所述彩色油菜的不同发育时期为半开放时期或完全开放时期。
6、所述彩色油菜的不同器官组织为花瓣、叶片或茎秆。
7、本发明还提供了一种用于扩增所述内参基因的特异性引物，特异性引物包括正向引物和反向引物，序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
8、本发明还提供了一种定量pcr检测体系，用于定量pcr检测彩色油菜不同花色、不同发育时期和/或不同器官组织中基因表达水平，使用ef-1α基因作为内参基因，所述ef-1α基因的编码序列如seq id no.1所示，扩增ef-1α基因的引物如seq id no.2和seq id no.3所示。
9、本发明还提供了所述的内参基因、所述的特异性引物或所述的定量pcr检测体系在彩色油菜不同花色、不同发育时期和/或不同器官组织中基因表达检测中的应用。
10、优选的，使用实时荧光定量pcr进行检测。
11、具体的，使用实时荧光定量pcr进行检测时，扩增体系为：cdna 2μl，10μmol/l的正、反向引物各1μl，2×tb green premix ex taq ii(tli rnaseh plus)12.5μl，ddh2o补至25μl；
12、扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火30s，共40个循环；
13、熔解曲线程序为：95℃变性10s；按每5s/0.5℃的升温速率从58℃升温至95℃。
14、申请人以3种花色(朱红色、玫红色、紫色)两个发育时期(半开放时期、完全开放时期)的油菜花瓣组织，以及两种颜色(绿色、紫色)的油菜叶片和茎秆组织作为实验材料，利用bnir油菜多组学数据库，并参考已完成的彩色油菜花瓣组织的转录组测序结果，选取8个基因作为候选内参基因，分别为肌动蛋白基因act7，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapc1，α微管蛋白基因tuba4，β微管蛋白基因tubb4，泛素基因ubc2、ubc7和ubc10，以及延伸因子ef-1α(序列如seq id no.1所示)。
15、根据软件分析结果再采用几何平均值分别计算不同花色、不同时期的油菜花瓣组织，以及不同颜色的油菜叶片、茎秆组织中候选内参基因的稳定性，通过综合排名筛选出表现相对稳定且适用范围最广的候选基因为ef-1α基因，再以ef-1α作为内参基因对彩色油菜不同发育时期花瓣组织中花青素代谢相关差异表达基因进行qrt-pcr验证，验证结果发现利用ef-1α基因的qrt-pcr内参引物对油菜花青素合成途径中14个色素合成相关基因表达水平的分析结果与转录组测序的分析结果完全一致。
16、本发明的有益效果：
17、本发明筛选出相对稳定且同时适用于花瓣、叶片和茎秆组织的内参基因ef-1α，所述的内参基因引物用于彩色油菜基因表达分析时，有助于提高qrt-pcr结果的可靠性，为参与彩色油菜色素代谢途径差异表达基因的研究提供有效的校正工具。
1.一种彩色油菜的内参基因，其特征在于，所述内参基因用于定量pcr检测彩色油菜不同花色、不同发育时期和/或不同器官组织中基因表达水平，所述内参基因为ef-1α基因，所述ef-1α基因的编码序列如seq id no.1所示。
2.如权利要求1所述内参基因，其特征在于，所述彩色油菜的不同花色为朱红色、玫红色或紫色。
3.如权利要求1所述内参基因，其特征在于，所述彩色油菜的不同发育时期为半开放时期或完全开放时期。
4.如权利要求1所述内参基因，其特征在于，所述彩色油菜的不同器官组织为花瓣、叶片或茎秆。
5.一种用于扩增权利要求1～4任一项所述内参基因的特异性引物，其特征在于，特异性引物包括正向引物和反向引物，序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
6.一种定量pcr检测体系，其特征在于，用于定量pcr检测彩色油菜不同花色、不同发育时期和/或不同器官组织中基因表达，使用ef-1α基因作为内参基因，所述ef-1α基因的编码序列如seq id no.1所示，扩增ef-1α基因的引物如seq id no.2和seq id no.3所示。
7.权利要求1～4任一项所述的内参基因、权利要求5所述的特异性引物或权利要求6所述的定量pcr检测体系在彩色油菜不同花色、不同发育时期和/或不同器官组织中基因表达检测中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，使用实时荧光定量pcr进行检测。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，使用实时荧光定量pcr进行检测时，扩增体系为：cdna 2μl，10μmol/l的正、反向引物各1μl，2×tb green premix ex taq ii(tlirnaseh plus)12.5μl，ddh2o补至25μl；
