本发明涉及病原菌的离体接种，特别是涉及一种玉米鞘腐病菌的离体接种扩繁方法。
背景技术：
1、玉米鞘腐病是玉米生产上的重要病害，其致病菌主要为层出镰孢菌。近年来，玉米鞘腐病已在我国多个省份发生，发生于玉米生育中后期，主要危害玉米叶鞘，受害叶鞘呈黑褐色腐烂症状，故称之为鞘腐病。近年该病有逐年加重发生的趋势，造成不同程度的玉米产量损失。因此，人们逐渐重视对玉米鞘腐病的研究和防治。人工接种是玉米鞘腐病研究的重要环节。作为兼性寄生菌，层出镰孢菌可在培养基和玉米植株上存活并繁殖，然而，玉米生长周期和活体接种发病时间均较长，因此，亟待开发一种离体接种扩繁方法以便快速鉴定层出镰孢在玉米叶鞘部位的致病性。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种玉米鞘腐病菌的离体接种扩繁方法，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供的离体接种方法具有节省大量时间和人力，减少孢子的损失和提高孢子利用率的优势，为研究玉米鞘腐病提供了高效、简便、快捷的菌种扩繁方法和技术支持。
2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
3、技术方案一：一种玉米鞘腐病菌的接种扩繁方法，包括依次利用固体培养基和液体培养基扩繁后，再在玉米叶鞘上进行扩繁的步骤。
4、进一步地，所述步骤包括：将玉米鞘腐病菌置于所述固体培养基上进行扩繁，将扩繁得到的玉米鞘腐病致病菌菌落的新生菌丝及其附着的固体培养基作为菌饼，将所述菌饼置于所述液体培养基中快速扩繁后制备菌液，将所述菌液接种于具有机械损伤的玉米叶鞘上进行扩繁培养，并对接种有菌液的玉米叶鞘进行保湿处理。
5、进一步地，所述菌液的制备方法包括：将所述菌饼置于所述液体培养基中快速扩繁后，离心过滤，与无菌水混合，得到所述菌液。
6、进一步地，所述菌液中，玉米鞘腐病致病菌层出镰孢的分生孢子的浓度为1*105个/ml。
7、进一步地，所述离心的转速为5000rpm，所述离心的时间为5min。
8、进一步地，所述液体培养基为cmc液体培养基；所述固体培养基为pda固体培养基。
9、进一步地，所述接种为以10μl菌液/每片叶鞘定量接种；所述接种的方式为离体接种。
10、进一步地，所述机械损伤用灭菌牙签划伤玉米叶鞘部位得到。
11、进一步地，将玉米鞘腐病菌置于所述固体培养基上后，在25℃下培养5d。
12、进一步地，将所述菌饼置于所述液体培养基中快速扩繁时的培养条件为28℃，200rpm下培养3d。
13、本发明公开了以下技术效果：
14、本发明首先将玉米鞘腐病菌层出镰孢菌于pda培养基中培养获得菌落，用cmc液体培养基培养进行分生孢子扩繁，收集分生孢子后接种到玉米离体叶鞘，使得玉米鞘腐病菌的扩繁速度和孢子的种类受到人为限制。本发明不受季节、外部环境和地域等因素的限制，有效地提高了玉米鞘腐病人工接种的成功率，能够准确控制玉米鞘腐病的接种时间，有利于观察和检测植株在接种前后特定时间节点的外观及内部指标动态变化。本发明提供的离体接种扩繁方法可广泛应用于我国不同地区层出镰孢菌致病情况分析，在分析和研究层出镰孢菌在玉米鞘腐病致病性方面具有节时节力的优势。
15、本发明方案中的固体培养基利于观察和分离纯化病原菌，之后接种于液体培养基扩繁速度快、效率高，能够快速获得大量的高活力分生孢子。本发明通过制备孢子悬浮液后用移液枪注射的方法，能够实现较高的接种成功率。与单一的方法相比，本发明收获分生孢子具有节省大量时间和人力、减少孢子损失和提高孢子利用率的优势，本发明提供的离体接种方法创造出玉米植株易被层出镰孢菌侵染的环境，增加层出镰孢菌侵染离体玉米叶鞘的可能性，为研究玉米鞘腐病提供了高效、简便、快捷的菌种接种扩繁方法和技术支持。
1.一种玉米鞘腐病菌的接种扩繁方法，其特征在于，包括依次利用固体培养基和液体培养基扩繁后，再在玉米叶鞘上进行扩繁的步骤。
2.根据权利要求1所述的接种扩繁方法，其特征在于，所述步骤包括：将玉米鞘腐病菌置于所述固体培养基上进行扩繁，将扩繁得到的玉米鞘腐病致病菌菌落的新生菌丝及其附着的固体培养基作为菌饼，将所述菌饼置于所述液体培养基中快速扩繁后制备菌液，将所述菌液接种于具有机械损伤的玉米叶鞘上进行扩繁培养，并对接种有菌液的玉米叶鞘进行保湿处理。
3.根据权利要求2所述的接种扩繁方法，其特征在于，所述菌液的制备方法包括：将所述菌饼置于所述液体培养基中快速扩繁后，离心过滤，与无菌水混合，得到所述菌液。
4.根据权利要求3所述的接种扩繁方法，其特征在于，所述菌液中，玉米鞘腐病致病菌层出镰孢的分生孢子的浓度为1*105个/ml。
5.根据权利要求3所述的接种扩繁方法，其特征在于，所述离心的转速为5000rpm，所述离心的时间为5min。
6.根据权利要求1所述的接种扩繁方法，其特征在于，所述液体培养基为cmc液体培养基；所述固体培养基为pda固体培养基。
7.根据权利要求2所述的接种扩繁方法，其特征在于，所述接种为以10μl菌液/每片叶鞘定量接种；所述接种的方式为离体接种。
8.根据权利要求2所述的接种扩繁方法，其特征在于，所述机械损伤用灭菌牙签划伤玉米叶鞘部位得到。
9.根据权利要求2所述的接种扩繁方法，其特征在于，将玉米鞘腐病菌置于所述固体培养基上后，在25℃下培养5d。
10.根据权利要求2所述的接种扩繁方法，其特征在于，将所述菌饼置于所述液体培养基中快速扩繁时的培养条件为28℃，200rpm下培养3d。
