本发明属于细胞培养，尤其涉及一种用于禽类肌肉干细胞培养的培养基组合及培养方法和应用。
背景技术：
1、细胞培育肉是一种新兴的技术，通过使用干细胞体外培养分化以及组织工程技术，在体外培养动物肌肉组织。
2、细胞培育肉的生产需要肌肉来源的干细胞作为种子细胞，经体外大规模扩增后再进行诱导分化形成肌纤维。骨骼肌卫星细胞是理想的种子细胞来源，但是由于生理上的特殊性，骨骼肌卫星细胞数量较少，因此探究能使这类细胞高效快速增殖的培养方法显得尤为重要。目前，细胞通常使用添加10%~20%血清的培养基进行培养，在这种条件下，细胞可以保持较好的生长状态。由于胎牛血清成本高昂，细胞培育肉的成本一直居高不下；但是，肌肉干细胞在低血清培养条件下又会导致生长速度减缓，增殖效率降低。因此，在降低血清使用比例的基础上，如何建立高效的肌肉干细胞扩增策略，是细胞培育肉发展目前需要解决的问题。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种用于禽类肌肉干细胞培养的培养基组合及培养方法和应用，本发明培养基组合及培养方法能够在降低血清使用比例的基础上，建立高效的禽类肌肉干细胞扩增策略。
2、本发明提供了一种用于禽类肌肉干细胞培养的培养基组合，包括独立包装的第一培养基、第二培养基和第三培养基；所述第一培养基以dmem-f12为基础培养基，包括以下浓度的组分：体积浓度为6%~8%的胎牛血清、体积浓度为1%的青链霉素、igf-1 20~200ng/ml和维生素a 0.2~1.2mg/ml；所述第二培养基以dmem-f12为基础培养基，包括以下浓度的组分：体积浓度为3%~5%的胎牛血清、体积浓度为1%的青链霉素、igf-1 40~200ng/ml、维生素a0.4~2mg/ml和egf 10~100ng/ml；所述第三培养基以dmem-f12为基础培养基，包括以下浓度的组分：体积浓度为2%的胎牛血清、体积浓度为1%的青链霉素、igf-1 40~200ng/ml、维生素a 0.4~2mg/ml、egf 10~100ng/ml、生长激素受体20~200ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子10~100ng/ml和前列腺素e2 5~50ng/ml。
3、优选的，所述培养基组合还包括初始培养基；所述初始培养基以dmem-f12为基础培养基，包括以下体积浓度的组分：10%的胎牛血清和1%的青链霉素。
4、本发明还提供了一种基于上述方案所述培养基组合的禽类肌肉干细胞低血清驯化培养的方法，包括以下步骤：1）将禽类肌肉干细胞接种于第一培养基，传代培养至细胞稳定；2）将步骤1）传代培养后的禽类肌肉干细胞接种于第二培养基，传代培养至细胞稳定；3）将步骤2）传代培养后的禽类肌肉干细胞接种于第三培养基，培养至细胞连续稳定生长。
5、优选的，在步骤1）前，还包括将禽类肌肉干细胞接种于初始培养基进行细胞培养，至细胞汇合度达到70%~80%后传代培养至细胞稳定。
6、优选的，在步骤3）中，所述培养的过程中每2天更换一次第三培养基。
7、本发明还提供了上述方案所述的培养基组合或者所述的方法在禽类肌肉干细胞低血清驯化培养中的应用；所述低血清驯化培养采用的培养基中胎牛血清的体积浓度≤8%。
8、优选的，所述禽类包括鸡。
9、优选的，所述肌肉干细胞包括骨骼肌卫星细胞。
10、本发明还提供了上述方案所述的培养基组合或者所述的方法在制备细胞培育肉中的应用。
11、本发明还提供了一种禽类肌肉干细胞的培养方法，包括以下步骤：
12、将上述方案所述的方法培养得到的禽类肌肉干细胞接种于第三培养基，进行悬浮培养。
13、本发明提供了一种用于禽类肌肉干细胞培养的培养基组合，包括独立包装的第一培养基、第二培养基和第三培养基；所述第一培养基以dmem-f12为基础培养基以dmem-f12为基础培养基，包括体积浓度为6%~8%的胎牛血清、青链霉素（青霉素-链霉素）、胰岛素样生长因子1（igf-1）和维生素a ；所述第二培养基包括体积浓度为3%~5%的胎牛血清、青链霉素、igf-1、维生素a 和egf；所述第三培养基以dmem-f12为基础培养基，包括体积浓度为2%的胎牛血清、青链霉素、igf-1、维生素、egfl、生长激素受体、碱性成纤维细胞生长因子和前列腺素e2。本发明的培养基组合能够用于禽类肌肉干细胞低血清驯化培养。其中，第一培养基中igf-1和维生素a作为细胞培养体系的营养补充，能够使禽类肌肉干细胞适应胎牛血清体积浓度降低带来的影响，同时维持禽类肌肉干细胞在培养体系内的稳定性；第二培养基中igf-1、维生素a 和egf作为细胞培养体系的必要营养补充，能够使禽类肌肉干细胞适应血清使用胎牛血清体积浓度进一步降低带来的影响，提升细胞增殖潜力，同时维持细胞在培养体系内的稳定性；所述第三培养基中igf-1、维生素、egfl、生长激素受体、碱性成纤维细胞生长因子和前列腺素e2作为细胞培养体系的必要营养补充，能够使禽类肌肉干细胞适应胎牛血清再次降低带来的影响，促进细胞贴壁与细胞间信号传递，刺激细胞增殖，使细胞能在当前培养体系下保持稳定。本发明的方案可以实现2%血清添加比例下的禽类肌肉干细胞连续传代培养，且增殖效率不低于未经驯化且使用含有10%胎牛血清的肌肉干细胞。
1.一种用于禽类肌肉干细胞培养的培养基组合，其特征在于，包括独立包装的第一培养基、第二培养基和第三培养基；
2.根据权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述培养基组合还包括初始培养基；所述初始培养基以dmem-f12为基础培养基，包括以下体积浓度的组分：10%的胎牛血清和1%的青链霉素。
3.一种基于权利要求1或2所述培养基组合的禽类肌肉干细胞低血清驯化培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤1）前，还包括将禽类肌肉干细胞接种于初始培养基进行细胞培养，至细胞汇合度达到70%~80%后传代培养至细胞稳定。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤3）中，所述培养的过程中每2天更换一次第三培养基。
6.权利要求1或2所述的培养基组合或者权利要求3~5任意一项所述的方法在禽类肌肉干细胞低血清驯化培养中的应用；所述低血清驯化培养采用的培养基中胎牛血清的体积浓度≤8%。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述禽类包括鸡。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肌肉干细胞包括骨骼肌卫星细胞。
9.权利要求1或2所述的培养基组合或者权利要求3~5任意一项所述的方法在制备细胞培育肉中的应用。
10.一种禽类肌肉干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
