本发明属于医学领域，具体而言，涉及一种通用型间充质干细胞及其构建方法和应用。
背景技术：
1、该背景技术的描述仅仅是对为了方便理解本发明的内容的一般描述，不构成对本发明的任何限制。
2、急性肺损伤(acute lung injury，ali)是一种常见的危及生命的肺部疾病，主要特征表现为肺泡和毛细血管通透性增高、肺组织结构损伤以及肺部炎症，目前尚无治疗ali的特效药。ali发病机制较为复杂，目前比较公认的机制是各种病因诱导肺内促炎因子增加，因此，控制炎症反应是治疗ali的关键措施。
3、目前临床上ali的治疗方法主要有：(1)机械通气治疗：是ali的经典治疗方式，然而，机械通气量不当可能导致肺泡过度膨胀，反而引起机械通气相关性肺损伤。在临床实践中，需针对不同患者应采用个性化通气策略，尽可能预防和减轻机械通气相关毒副作用。如何在充分发挥机械通气治疗作用的基础上避免呼吸系统并发症，仍然是其在ali治疗领域中亟待解决的重大问题；(2)化学药物治疗：常见用来治疗急性肺损伤的化学药物包括糖皮质激素、抗生素、中药制剂、蛋白酶抑制剂、抗凝药物、舒血管药物等，尽管这些药物对于ali的治疗有一定疗效，但存在副作用。
4、近年来，以间充质干细胞(mscs)为代表的干细胞疗法成为抗炎治疗的潜在临床手段。mscs是一种可以自我更新的干细胞，具有多向分化、免疫调节和抗炎能力，倾向于迁移至炎症部位，通过旁分泌等途径发挥免疫调节功能，促进组织修复再生，能缓解多器官疾病及病毒引起的肺部并发症，从而达到疾病治疗的效果。然而，同种异体免疫排斥仍然是阻碍mscs临床广泛应用的一个瓶颈问题。尽管通常认为mscs是具有低免疫原性，但在病理炎症环境中，ifnγ等促炎因子能够刺激mscs上调hla-i，提高mscs的免疫原性，导致mscs被免疫排斥而无法持续发挥其治疗作用。且自体mscs受限于细胞来源不足、批次不稳定、售价高和制备周期长等瓶颈，难以在临床治疗中得以广泛使用，而同种异体来源的mscs虽然能一定程度解决上述瓶颈问题，却受限于同种异体免疫排斥，导致mscs无法在受体体内持续发挥其治疗作用，从而疗效不佳。
5、在申请公布号为cn113846063a的发明专利中，发明人在前期实验中已构建得到一种适用于同种异体移植的通用型人源干细胞，通过将干细胞中b2m基因的增强子基因序列部分敲低或沉默，可以使干细胞在炎症环境下维持低免疫原性。但所述构建方法中，采用慢病毒转导的转染方式，但一方面，该方法涉及到的慢病毒转导方式的操作程序较复杂，对细胞类型有很强的选择性，且对研发人员的操作要求较高，在一般实验室中很难普及；另一方面，病毒dna会永久性整合到mscs基因组上，可能带来潜在的安全隐患；且并未对所述通用型间充质干细胞在肺损伤中的应用及作用机制进行深入研究。
6、因此，急需开发一种安全稳定、以及具有更低的免疫原性的通用型间充质干细胞的构建方法，并明确所述通用型间充质干细胞在急性肺损伤中的作用机制及其相关应用，以期为急性肺损伤以及其他病症的临床治疗提供新的策略。
技术实现思路
1、为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种通用型间充质干细胞及其构建方法和应用，采用电转染和crisproff基因编辑方法结合的方式构建得到一种全新的通用型间充质干细胞，所述构建得到的通用型间充质干细胞，与未经编辑的间充质干细胞和其他转染方式构建得到的间充质干细胞相比，能在肺部炎性病理环境中稳定存活，持续发挥治疗作用，并对急性肺炎的病理表型和多项生化检测指标有更显著的改善作用，解决了基于干细胞移植的再生疗法中人体免疫系统对同种异体干细胞的免疫排斥问题，为急性肺炎疾病提供了一种有效的全新细胞疗法，也为急性肺炎疾病的临床治疗提供了技术支撑与新的思路，具有良好的应用前景。
2、为了达到上述目的，本发明采用以下方案实现：
3、一方面，本发明提供一种通用型间充质干细胞的构建方法，包括以下步骤：
4、(1)准备间充质干细胞；
5、(2)配制转染复合物；
6、(3)将质粒转染到细胞中；
7、所述步骤(3)中，使用电转染方式将质粒混合物转染到间充质干细胞中。
8、在申请公布号为cn113846063a和cn113801881a的发明专利中，发明人前期已经构建获得了“一种适用于同种异体移植的通用型人源干细胞”，但未应用到急性肺损伤等具体适应症中，这与前期采用慢病毒转导方式有关：一方面由于慢病毒转导方式的操作程序较复杂，对细胞类型有很强的选择性，且对研发人员的操作要求较高，在一般实验室中很难普及；另一方面，虽然间充质干细胞通常被认为免疫原性较低，但慢病毒载体及其转基因产物可能引发免疫反应，导致机体对改造后的细胞产生排斥；同时慢病毒随机插入到细胞基因组中，有可能会破坏细胞内重要的基因功能，甚至导致细胞恶变；这些都可能带来潜在的安全隐患。因此在本发明的研究中，进一步对通用型间充质干细胞的构建方法进行了优化，以期构建得到一种更安全稳定的通用型间充质干细胞，且在各种适应症的应用中，均具有很好的治疗效果。
9、因此本发明中，通过采用电转染结合crisproff的方法，构建得到一种全新的通用型间充质干细胞，所述通用型间充质干细胞，在炎症环境中能维持低免疫原性的能力，使其在移植后能规避免疫排斥而稳定发挥其治疗作用，明显改善ali症状，并对受损的肺组织具有更好的再生修复效果，且相比于采用慢病毒转导和脂质体转染的方法，本发明构建得到的通用型间充质干细胞具有最佳的转染效率和细胞活性。这可能是因为电穿孔是通过高强度电场引起细胞膜电位变化，瞬时提高细胞膜通透性，使细胞膜上产生可逆性小孔便于外源核酸的进入，适用于几乎所有类型的细胞。
10、进一步地，所述步骤(2)中，转染复合物包括间充质干细胞和质粒混合物；所述质粒混合物中，包括crisproff质粒和sgrna质粒。
11、进一步地，所述步骤(2)中，质粒用量为400-800ng。
12、在一些实施方式中，为进一步提高本发明通用型间充质干细胞构建方法中的转染效率以及细胞活率，对不同的质粒用量进行了筛选：实验结果表明：随着质粒用量增加，双阳性细胞群比例逐渐升高，从3.7％升至15.9％。而当质粒用量超过800ng时，细胞活率发生明显下降，这可能是因为出现饱和效应或由于过多的质粒与细胞相互作用而产生一些非预期的影响。因此本发明优选质粒的用量为800ng。
13、进一步地，所述步骤(2)中，crisproff质粒和sgrna质粒的质量比为1：1。
14、进一步地，所述步骤(3)电转染参数中，电压为990v-1400v，电脉冲持续时间为10ms-40ms，脉冲次数为1-3次。
15、在一些实施方式中，为在实现良好的转染效率的同时尽可能降低对细胞的损伤，提高细胞的存活率，对不同的电转参数进行了筛选，实验结果表明：在1400v/10ms/3pulse电转条件下，同时达到了较高的电转效率，此时电转效率为93.58％，因此本发明优选电转参数为1400v/10ms/3pulse制备通用型间充质干细胞。
16、另一方面，本发明提供一种通用型间充质干细胞，所述通用型间充质干细胞采用如上技术方案中任一项所述的构建方法构建得到。
17、再一方面，本发明提供一种通用型间充质干细胞用于制备提高肺损伤修复再生能力的制剂的用途，所述通用型间充质干细胞采用如上技术方案中任一项所述的构建方法构建得到。
18、在一些实施方式中，为验证本发明制得的通用型间充质干细胞具有更显著的急性肺损伤的治疗效果，构建lps致急性肺炎模型并进行体内生物发光成像追踪实验，同时还进行he染色实验、肺泡灌洗液的生化指标检测实验。
19、其中，肺部组织离体观察实验结果表明：ntmscs治疗组相较于pbs治疗组，肺组织炎症和充血现象有所改善，但对比组仍有较重的肺炎症状，说明ntmscs对于肺炎的治疗效果有限；而globes治疗组的肺组织相较于pbs治疗组有很好的肺炎改善效果，且和组的正常肺组织更为贴近，说明globes对于肺炎有着更好的治疗效果。同时在后续的实验中也进行了globes-1治疗组和globes-2治疗组的对比，实验结果表明，相比于globes-1和globes-2治疗组，globes治疗组的肺组织其炎症和充血现象明显减轻，这表明通过电转染方式构建得到的globes治疗组具有更显著的肺炎改善效果。
20、he染色实验结果表明：相比于组的正常肺组织，lps致pbs组小鼠的肺组织出现典型的急性肺炎损伤现象。ntmscs治疗后虽然一定程度上减轻了上述急性肺损伤现象，但相较于组的正常肺组织仍可清晰地看出较多肺损伤区域。而globes治疗组的肺组织切片显著不同于ntmscs组，而更相近于组的正常肺组织切片形态，说明globes治疗后肺损伤得到很大程度的改善和修复。且在后续的实验中也分别与globes-1治疗组和globes-2治疗组进行了对比，实验结果表明，相比于globes-1和globes-2治疗组，globes治疗组治疗后肺损伤得到明显的改善和修复，这也进一步表明通过电转染方式构建得到的globes治疗组具有更显著的肺损伤修复效果。
21、肺泡灌洗液中ldh含量检测结果表明：pbs、ntmscs、globes-1和globes-2四组的肺泡灌洗液中ldh含量要明显高于globes治疗组和组；其中，ntmscs治疗组的ldh含量约是globes治疗组的2.05倍；而ldh在正常情况下仅存在于机体组织细胞的胞质内，当肺泡灌洗液中ldh含量越高，则表明组织损伤越严重，因此说明globes治疗后肺损伤得到很大程度的改善和修复。且在后续的实验中也分别对globes-1治疗组和globes-2治疗组肺泡灌洗液中ldh含量进行检测，实验结果表明，globes-1治疗组的ldh含量约是globes治疗组的1.72倍；globes-2治疗组的ldh含量约是globes治疗组的1.85倍；相比于ntmscs治疗组，globes-1和globes-2治疗组中ldh含量虽略有下降，但相比于globes治疗组，仍有显著增加，这也进一步表明通过电转染方式构建得到的globes治疗组具有更显著的肺损伤修复效果。因此可知，肺泡灌洗液中ldh含量的检测结果也进一步证明通过电转染方式构建得到的globes治疗组具有更显著的修复急性肺炎损伤的效果。
22、肺泡灌洗液中白蛋白含量检测结果表明：ntmscs治疗组虽然能够一定程度上降低肺泡灌洗液中白蛋白含量，但相应白蛋白含量仍显著高于组的白蛋白含量；且ntmscs治疗组肺泡灌洗液中白蛋白含量约是globes治疗组的1.43倍；且在后续的实验中也分别对globes-1治疗组和globes-2治疗组肺泡灌洗液中ldh含量进行检测，实验发现，globes-1治疗组肺泡灌洗液中白蛋白含量约是globes治疗组的1.28倍；globes-2治疗组肺泡灌洗液中白蛋白含量约是globes治疗组的1.32倍；相比于ntmscs治疗组，globes-1和globes-2治疗组肺泡灌洗液中白蛋白含量虽略有下降，但相比于globes治疗组，仍发生增加；而globes治疗组中白蛋白含量趋近于组的正常白蛋白含量。因此可知，肺泡灌洗液中白蛋白含量的检测结果也进一步证明通过电转染方式构建得到的globes治疗组具有更显著的修复急性肺炎损伤的效果。
23、肺泡灌洗液中总蛋白含量以及总细胞数检测结果表明：总蛋白含量的测定结果也类似于白蛋白的测定结果，ntmscs治疗组肺泡灌洗液中总蛋白含量约为globes治疗组的1.22倍；且在后续的实验中也发现globes-1治疗组和globes-2治疗组肺泡灌洗液中总蛋白含量分别约为globes治疗组的1.12倍以及1.15倍；globes-1治疗组和globes-2治疗组肺泡灌洗液中总蛋白含量相比于ntmscs治疗组虽略有下降，但相比于globes治疗组，仍发生增加；同样地，ntmscs治疗组肺泡灌洗液中总细胞数为globes治疗组的1.77倍；且在后续的实验中也发现globes-1治疗组和globes-2治疗组的肺泡灌洗液中总细胞数分别为globes治疗组的1.31倍、1.42倍，globes-1治疗组和globes-2治疗组肺泡灌洗液中总细胞数相比于globes治疗组，也发生明显增加，同时globes治疗组肺泡灌洗液中总细胞数和组之间无统计学差异。
24、因此上述结果均证实了赋予同种异体mscs免疫兼容特性有助于mscs在病理环境下长期存活，从而稳定发挥抗炎和治疗作用，实现损伤组织的再生修复，且相比于慢病毒转导和脂质体转染构建得到的通用型mscs，由本发明中最佳电转染方法构建得到的通用型mscs，才具有最显著的肺损伤治疗效果。
25、再一方面，本发明提供一种通用型间充质干细胞用于制备降低同种异体免疫排斥反应的制剂的用途，所述通用型间充质干细胞采用如上技术方案中任一项所述的构建方法构建得到。
26、在一些实施方式中，为验证globes在肺部炎性病理环境下仍能维持其低免疫原性，进行globes体内移植后回收实验，实验结果表明：在体内肺炎环境中对照ntmscs(ntmscs in vivo)的hla-i表达量相较于体外培养的ntmscs(ntmscs in vitro)上升了8.5倍；而globes在体内(globes in vivo)仍然维持了低hla-i表达量，表达量相较于体外培养的globes(globes in vitro)仅上升2倍左右，且该hla-i表达量仅为ntmscs体内hla-i表达量的20.7％。同时在后续的实验中也发现globes-1组(globes-1in vivo)的hla-i表达量和globes-2组(globes-2in vivo)的hla-i表达量相较于体外培养组也均有明显上升。因此可知，相比于未编辑的mscs、慢病毒转导的globes-1以及脂质体转染的globes-2，本发明中通过最佳电转染方式构建得到的globes在肺部炎性病理环境下仍能维持其低免疫原性。
27、再一方面，本发明提供一种通用型间充质干细胞用于制备降低肺泡灌洗液中的乳酸脱氢酶、白蛋白和/或总蛋白含量的制剂的用途，所述通用型间充质干细胞采用如上技术方案中任一项所述的构建方法构建得到。
28、再一方面，本发明提供一种通用型间充质干细胞用于制备降低肺泡灌洗液中的乳酸脱氢酶、白蛋白和/或总蛋白含量的制剂的用途，所述通用型间充质干细胞采用如上技术方案中任一项所述的构建方法构建得到。
29、在一些实施方式中，对不同组别luc-globes、luc-ntmscs中，小鼠体内移植细胞存活量分别进行测试，实验结果表明：相比于未编辑的mscs，本发明中通过最佳电转染方式构建得到的globes不引起同种异体mscs的免疫反应，可在人免疫系统重建小鼠体内存活更长时间。
30、同时在后续的实验中也对注射等量的luc-globes-1或luc-globes-2细胞的小鼠进行上述同样操作，并分别对比细胞存活量结果，结果发现，globes-1和globes-2组中，虽未出现明显的免疫排斥致细胞死亡现象，但细胞存活量也发生明显降低。
31、因此进一步证明相比于未编辑的mscs、慢病毒转导的globes-1以及脂质体转染的globes-2，本发明中通过最佳电转染方式构建得到的globes不引起同种异体mscs的免疫反应，可在人免疫系统重建小鼠体内存活更长时间。
32、再一方面，本发明提供一种通用型间充质干细胞用于制备提高间充质干细胞在体内炎性环境中的存活时间或使间充质干细胞在体内维持低免疫原性的制剂的用途，所述通用型间充质干细胞采用如上技术方案中任一项所述的构建方法构建得到。
33、本发明的有益效果为：
34、1、本发明应用电转染结合表观编辑crisproff的方式，构建得到一种在炎症环境中仍然能维持低免疫原性的通用型间充质干细胞，静脉注射入体内后能够不引起免疫排斥反应；且相比于未经处理的间充质干细胞、慢病毒转导或脂质体转染构建的通用型间充质干细胞，一方面具有更好的肺炎治疗效果和受损肺组织的再生修复效果，并对急性肺炎的病理表型和多项生化检测指标有更显著的改善作用；另一方面能在肺部疾病病理环境中维持低免疫原性，解决了基于干细胞移植的再生疗法中人体免疫系统对同种异体干细胞的免疫排斥问题；同时可在肺部疾病病理环境中存活更长时间，从而发挥更好的抗炎效果。
35、2、本发明应用电转染结合表观编辑crisproff的方式构建通用型间充质干细胞，在安全性方面，该表观编辑的方式不会对基因组细胞的基因组序列产生影响，构建方法安全简便；同时应用本发明方法基因编辑后的通用型间充质干细胞不具有体内成瘤的能力，使用本发明通过表观编辑构建的炎症环境下维持低免疫原性的通用型间充质干细胞治疗急性肺损伤，为急性肺炎疾病的临床治疗提供了一种新型的安全有效的治疗策略。
36、3、本发明应用电转染结合表观编辑crisproff的方式构建通用型间充质干细胞，为间充质干细胞治疗急性肺损伤提供了全新的细胞来源和有效的治疗手段，所述通用型间充质干细胞移植后能规避免疫排斥而稳定发挥其治疗作用，明显改善急性肺损伤症状，为急性肺炎疾病的临床治疗提供了技术支撑与新的思路，具有良好的应用前景。
1.一种通用型间充质干细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，转染复合物包括间充质干细胞和质粒混合物；所述质粒混合物中，包括crisproff质粒和sgrna质粒。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，质粒用量为400-800ng。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，crisproff质粒和sgrna质粒的质量比为1：1。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)电转染参数中，电压为990v-1400v，电脉冲持续时间为10ms-40ms，脉冲次数为1-3次。
6.一种通用型间充质干细胞，其特征在于，采用如权利要求1～5中任一项所述的构建方法构建得到。
7.一种通用型间充质干细胞用于制备提高肺损伤修复再生能力的制剂的用途，其特征在于，采用如权利要求1～5中任一项所述的构建方法构建得到。
8.一种通用型间充质干细胞用于制备降低同种异体免疫排斥反应的制剂的用途，其特征在于，采用如权利要求1～5中任一项所述的构建方法构建得到。
9.一种通用型间充质干细胞用于制备降低肺泡灌洗液中的乳酸脱氢酶、白蛋白和/或总蛋白含量的制剂的用途，其特征在于，采用如权利要求1～5中任一项所述的构建方法构建得到。
10.一种通用型间充质干细胞用于制备提高间充质干细胞在体内炎性环境中的存活时间或使间充质干细胞在体内维持低免疫原性的制剂的用途，其特征在于，所述方法中采用通用型间充质干细胞，所述通用型间充质干细胞采用如权利要求1～5中任一项所述的构建方法构建得到。
