本发明属于生物医药，涉及基因编辑领域，具体涉及一种造血干细胞基因编辑的方法、组合物及其应用。
背景技术：
1、急性髓系白血病(aml)主要由造血系统中原始骨髓细胞恶性集落增殖所引起，其特征是骨髓母细胞异常增殖和抑制正常造血细胞的生长，患者常出现全血细胞(红细胞、白血病和血小板)减少，引起贫血、感染和出血的临床症状。化疗是大多数aml患者的标准治疗方案，临床上常采用阿糖胞苷等联合用药。中、高危患者常采用同种异体造血干细胞移植(allo-hsct)，该方案有良好的疗效，同时比化疗有更低的复发率，allo-hsct是目前唯一的aml治愈方式。然而aml预后较差，移植后原发病复发仍是导致患者死亡的最主要原因。
2、人c型凝集素样分子1(cll1)，也称为clec12a，是一种ii型跨膜糖蛋白，由一个具有6个n-糖基化位点的细胞外碳水化合物识别域、一个跨膜区和一个细胞内nh2末端组成，存在于外周血和骨髓的髓系细胞以及大部分aml细胞中。cll1在白血病干细胞(lsc)上表达，但是在造血干细胞(hsc)上不表达，因此cll1是目前aml治疗的极具潜力的靶向治疗靶点。有关cll1的药物开发，进入临床阶段的基本上都是car-t细胞疗法。目前的临床数据证明了cll1在aml中的治疗潜力，为r/r aml患者(复发性和/或难治性急性髓系白血病患者)提供在移植前达到cr/cri(完全缓解或血细胞计数未完全恢复的完全缓解)的机会。获得cr/cri后，根据有无供者、社会经济、自身状况、个人意愿等因素，尽快选择allo-hsct或继续巩固化疗。
3、尽管在aml细胞和lscs中表达强度更高，但cll1在正常髓系细胞中也有表达，使得靶向cll1的car-t细胞识别进攻正常髓系细胞产生脱靶毒性，导致中性粒细胞减少等各种不良反应，部分患者出现难以控制的感染。通过降低car-t细胞输入数量可以一定程度提升安全性，然而并没有观察到明显的临床疗效。在造血干细胞中敲除cll1基因，使其分化的细胞在行使功能的同时不被cll1 car-t细胞识别和杀伤，能够解决cll1 car-t脱靶毒性导致的长期粒细胞缺乏等不良反应，为aml患者带来更高的治愈率。将car-t细胞治疗与造血干细胞移植疗法的联合应用将是解决脱靶毒性问题的有效策略之一。
4、crispr-cas9基因编辑技术是通过人工设计的grna来识别目的基因组序列，并引导cas9蛋白酶进行有效切割dna双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除等，最终达到对基因组dna进行编辑的目的。鉴于此，研究和开发高效、精准的基因编辑方法对造血干细胞进行改造，对aml的治疗具有重要的临床意义。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种靶向并引导cas9蛋白高效切割cll1基因的sgrna、造血干细胞基因编辑的方法及其在肿瘤免疫治疗中的应用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
2、为实现上述目的，本发明首先提供了sgrna，所述sgrna包括识别区和框架区，所述识别区的核苷酸序列可为seq id no.5的第1-20位、seq id no.6的第1-20位或seq idno.7的第1-20位。
3、进一步地，所述框架区的核苷酸序列可为seq id no.4或与seq id no.4限定的核苷酸序列具有90％以上同一性且具有相同功能的序列。
4、进一步地，所述sgrna的核苷酸序列可如seq id no.5、seq id no.6或seq idno.7所示。
5、所述框架区负责与cas蛋白结合。所述识别区负责与cll1基因的靶点结合，引导cas蛋白到达靶点。
6、所述sgrna可为靶向人cll1基因的sgrna。
7、seq id no.5所示的sgrna名称可为sgrna2；seq id no.6所示的sgrna名称可为sgrna3；seq id no.7所示的sgrna名称可为sgrna4。
8、本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
9、a1)编码本文中任一所述sgrna的dna分子；
10、a2)含有a1)所述dna分子的表达盒；
11、a3)含有a1)所述dna分子的重组载体；
12、a4)含有a1)所述dna分子的重组微生物；
13、a5)含有a1)所述dna分子的重组宿主细胞。
14、所述生物材料均能够表达所述sgrna。
15、进一步地，a1)中所述dna分子包括核苷酸序列为seq id no.1、seq id no.2、seqidno.3、seq id no.8、seq id no.9或seq id no.10的dna分子。
16、seq id no.1所示的dna分子编码sgrna2识别区；seq id no.2所示的dna分子编码sgrna3识别区；seq id no.3所示的dna分子编码sgrna4识别区；seq id no.8所示的dna分子编码sgrna2；seq id no.9所示的dna分子编码sgrna3；seq id no.10所示的dna分子编码sgrna4。
17、进一步地，a3)中所述重组载体包括将编码所述sgrna的dna分子与载体在体外连接构建而成的重组体dna分子。重组载体可以任何合适的方式构建，只要构建的重组载体可以携带所述sgrna进入受体细胞或微生物，并能表达所述sgrna，使其执行对靶基因的敲除功能即可。
18、进一步地，所述重组载体可以是表达所述sgrna和cas蛋白的基因编辑载体。构建基因编辑载体的方法是本领域技术人员熟知的，可以根据设计的向导rna(如本发明的sgrna)选择与其匹配(或结合)的cas蛋白，只要能够实现实验目的(如基因敲除)即可。例如可以将sgrna与cas蛋白连入同一个载体中并以双启动子启动，也可以将sgrna与cas蛋白分别连在不同的载体上，或者也可以选择已经含有cas蛋白基因的骨架载体(如px459载体、px458载体、px461载体、px462载体、px551载体、px552载体、pgk1.1载体、px330载体、px335载体、px165载体、espcas9(1.1)载体等)作为sgrna的表达载体，将编码sgrna的dna分子克隆至该骨架载体中，构建得到靶向目标基因的基因编辑载体。
19、本发明还提供了一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物包括b1)和b2)：
20、b1)本文中任一所述的sgrna，或所述生物材料；
21、b2)cas蛋白或编码cas蛋白的核酸分子。
22、上述基因编辑组合物中，所述cas蛋白可选自cas9、cas12a、cas12b、cas12i3、cas13a、cas13b和cas13c。
23、进一步地，本文所述cas蛋白可为cas9蛋白。所述cas9蛋白不限于特定的某一种蛋白，只要能与本发明sgrna配合使用即可。
24、进一步地，本文所述cas9蛋白包括化脓链球菌(streptococcus pyogenes)cas9(spcas9，ii-a亚型)、spcas9 hf(高保真)、缺刻酶cas9(ncas9)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)cas9(sacas9，ii-a亚型)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseriameningitidis)cas9(nmcas9，ii-c亚型)、新凶手弗朗西斯菌(francisella novicida)cas9(fncas9，ii-b亚型)、嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)cas9(st1cas9、st3cas9)、空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)cas9(cjcas9)和密螺旋体(treponemasp.)cas9，以及其他生物体的cas9直系同源物但不限于此。所述cas9蛋白还可包括高保真cas9突变体(如：spcas9-hf1、espcas9-1.1和truecuttmhifi cas9蛋白)等。
25、在本发明的一个或多个实施方案中，所述sgrna适用于crispr/cas9基因编辑系统，即所述sgrna可与cas9蛋白结合，并指导cas9蛋白对靶位点进行切割。
26、本发明的方法可以用本领域已知的任何cas9蛋白实施。本领域技术人员在不脱离本发明实施例原理的前提下，可以对cas9蛋白的编码序列做出合适的选择。
27、尽管本发明的方法通常使用cas9蛋白来实施，但是可以预见，在一些方面，cas蛋白可以是cas1、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7或cas8。在一些方面，可用于本发明的cas蛋白包含i型cas蛋白。i型cas蛋白的非限制性实例包括cas3、cas5、cas6、cas7、cas8a、cas8b、cas8c、cas10d、cse1、cse2、csy1、csy2、csy3及其变体。在一些方面，可用于本发明的cas蛋白包含ii型cas蛋白。ii型cas蛋白的非限制性实例包括cas9、csn2、cas4及其变体。在一些方面，可用于本发明的cas蛋白包含iii型cas蛋白。非限制性实例包括cas10、csm2、cmr5、csx10、csx11及其变体。在一些方面，可用于本发明的cas蛋白包含iv型cas蛋白。这种cas蛋白的非限制性实例包括csf1。在一些方面，可用于本发明的cas蛋白包含v型cas蛋白。非限制性实例包括cas12、cas12a(cpf1)、cas12b(c2c1)、cas12c(c2c3)、cas12d(casy)、cas12e(casx)、cas12f(cas14、c2c10)、cas12g、cas12h、cas12i、cas12k(c2c5)、c2c4、c2c8、c2c9及其变体。在一些方面，可用于本发明的cas蛋白包含vi型cas蛋白。vi型cas蛋白的非限制性实例包括cas13、cas13a(c2c2)、cas13b、cas13c、cas13d及其变体。
28、进一步地，所述基因编辑组合物还可包括递送系统，所述递送系统选自聚合物纳米颗粒、脂质体、脂质纳米颗粒、病毒载体或细胞外囊泡中的一种或多种。
29、所述基因编辑组合物可为一种crispr/cas9基因编辑系统。
30、本发明还提供了本文中任一所述的sgrna、所述生物材料、或所述基因编辑组合物在下述任一项中的用途：
31、c1)在特异性识别cll1基因中的用途；
32、c2)在敲除cll1基因中的用途；
33、c3)在制备敲除cll1基因的试剂或试剂盒中的用途；
34、c4)在制备cll1基因敲除的细胞中的用途；
35、c5)在制备用于预防或治疗cll1靶点相关疾病的产品中的用途；
36、c6)在制备用于与靶向cll1的car细胞联合治疗cll1靶点相关疾病的产品中的用途。
37、进一步地，c4)中所述细胞可为含有内源cll1基因的细胞、表达cll1抗原的细胞、造血干细胞、造血祖细胞、aml细胞或白血病干细胞。
38、含有内源cll1基因的细胞和表达cll1抗原的细胞的鉴定是本领域技术人员熟知的。例如，为了确定细胞是否含有和/或表达cll1，可以通过原位杂交或rt-pcr(包括定量rt-pcr)的方法来测定cll1 mrna的表达，也可以使用针对cll1蛋白的抗体通过免疫组织化学或facs等方法来测定细胞表面上的cll1蛋白表达。
39、进一步地，c4)中所述细胞可为造血干细胞和/或造血祖细胞。
40、进一步地，c5)和c6)中所述cll1靶点相关疾病可为cll1阳性癌症(即表达cll1的癌症)。
41、进一步地，所述cll1阳性癌症可为急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，aml)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，mds)或慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia，cml，慢性粒细胞白血病)。
42、进一步地，所述急性髓细胞白血病(aml)可为难治性和/或复发性急性髓细胞白血病(r/raml)。
43、进一步地，c6)中所述的靶向cll1的car细胞可为靶向cll1的car-t细胞。
44、所述靶向cll1的car-t细胞可以是任意能够特异性识别和杀伤表达cll1抗原的t细胞，其含有并表达靶向cll1的嵌合抗原受体(car)。制备嵌合抗原受体以及包含该嵌合抗原受体的t细胞的方法是本领域已知的，可用至少一种编码car的核酸分子稳定转染t细胞，成为car-t细胞。例如，在本发明的一个实施方案中，所述car-t细胞是通过将核苷酸序列为seq id no.13的car基因(该car基因含有2个特异性识别cll1的单域抗体)转入t细胞中稳定表达得到。
45、本发明还提供了一种制备cll1基因敲除的细胞的方法，所述方法包括利用本文中任一所述的sgrna或所述基因编辑组合物将受体细胞中的cll1基因敲除。
46、上述方法中，所述将受体细胞中的cll1基因敲除可以是通过使所述受体细胞中的cll1基因与本文中任一所述的sgrna和cas蛋白接触。
47、上述方法中，所述接触的步骤可通过如下d1)和d2)进行：
48、d1)直接将本文中任一所述的sgrna导入所述受体细胞，或先将编码本文中任一所述sgrna的dna分子构建到表达载体中再导入所述受体细胞；
49、d2)直接将cas蛋白或cas蛋白的mrna导入所述受体细胞，或先将编码所述cas蛋白的dna分子构建到表达载体中再导入所述受体细胞，或将cas蛋白与穿膜肽融合后，通过穿膜肽引入所述受体细胞。
50、本领域技术人员已知：cas蛋白、cas蛋白mrna、cas表达载体(含有且表达编码cas蛋白的dna分子的载体)、sgrna、sgrna表达载体(含有且表达编码sgrna的dna分子的载体)可以通过本领域中已知的各种方法转移到细胞中，如显微注射、电转染(电转化法、电穿孔法)、阳离子聚合物法(如deae-葡聚糖转染法)、脂质体介导法、脂质纳米颗粒介导的转染、蛋白质转导结构域介导的转导、磷酸钙共沉淀法、病毒载体法、基因枪法等但不限于此。
51、当使用表达载体递送sgrna与cas蛋白时，sgrna与cas蛋白可以连接在不同的表达载体中表达，也可以连入同一个表达载体中表达。
52、在本发明的一个实施方案中，所述导入的方法为电转化法。
53、进一步地，所述穿膜肽用于促进与其融合的cas蛋白被细胞摄取和吸收，并在细胞内发挥生物学功能。合适的穿膜肽不局限于特定种类，只要能实现携带cas蛋白穿膜、内化的目的即可。所述穿膜肽包括但不限于人类免疫缺陷病毒hiv的转录反式激活因子tat、果蝇同源异型转录因子antp、单纯疱疹病毒1型(hsv-1)转录因子vp22以及人工合成的多聚精氨酸和多聚赖氨酸。
54、进一步地，所述穿膜肽包含至少5个精氨酸或赖氨酸残基，并且所述穿膜肽的总长度为5-30个氨基酸。优选的穿膜肽是来自hiv病毒的tat蛋白(如tat肽，ygrkkrrqrrr，seqid no.16)。
55、进一步地，所述方法可包括如下步骤：
56、(1)将核苷酸序列如seq id no.5、seq id no.6或seq id no.7所示的sgrna与cas9蛋白混合，得到rnp复合物；
57、(2)通过电转化的方法将所述rnp复合物转入所述受体细胞，得到重组细胞；
58、(3)培养所述重组细胞，提取基因组dna，进行基因编辑检测。
59、进一步地，所述sgrna与cas9蛋白的质量比可为1：(1～4)。
60、进一步地，所述sgrna与cas9蛋白的质量比可为1：1、1：1.5、1：2、1：2.5、1：3、1：3.5或1：4。
61、上述方法中，所述受体细胞可为含有内源cll1基因的细胞、表达cll1抗原的细胞、造血干细胞、造血祖细胞、aml细胞或白血病干细胞。
62、进一步地，所述受体细胞可为造血干细胞和/或造血祖细胞。
63、进一步地，当所述受体细胞为造血干细胞和/或造血祖细胞时，所述方法还包括首先通过磁珠法分选cd34+细胞的步骤，然后再将所述sgrna和cas9蛋白导入所述cd34+细胞。
64、进一步地，所述cd34+细胞可从动员外周血中进行分选。
65、本发明还提供了由本文中任一所述的制备cll1基因敲除的细胞的方法得到的cll1基因敲除的细胞，所述cll1基因敲除的细胞可含有本文中任一所述的sgrna或所述基因编辑组合物。
66、进一步地，所述cll1基因敲除的细胞可为cll1基因敲除的造血干细胞。
67、进一步地，所述cll1基因敲除的造血干细胞具有下述至少一种特性：
68、(1)能避免靶向cll1的car细胞(如cll1 car-t细胞)的识别和杀伤；
69、(2)具有良好的髓系分化功能；
70、(3)具有高度的自我更新能力；
71、(4)具有较高的、长期的造血重建能力；
72、(5)所述cll1基因敲除的造血干细胞分化的髓系细胞具有正常良好的功能；
73、(6)所述cll1基因敲除的造血干细胞分化的髓系细胞能避免靶向cll1的car细胞(如cll1 car-t细胞)的识别和杀伤。
74、本发明还提供了上述所述的cll1基因敲除的细胞在制备用于预防或治疗cll1靶点相关疾病的产品中的用途，所述cll1基因敲除的细胞可为cll1基因敲除的造血干细胞和/或造血祖细胞。
75、本发明还提供了上述所述的cll1基因敲除的细胞与靶向cll1的car细胞联合在制备用于预防或治疗cll1靶点相关疾病的产品中的用途，所述cll1基因敲除的细胞可为cll1基因敲除的造血干细胞和/或造血祖细胞。
76、本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包括上述所述的cll1基因敲除的细胞，以及一种或多种药学上可接受的载体；所述cll1基因敲除的细胞可为cll1基因敲除的造血干细胞和/或造血祖细胞。
77、所述药学上可接受的载体选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、防腐剂、稳定剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂、润滑剂、烟雾化剂、悬浮剂、增塑剂和分散剂。
78、所述药物组合物的剂型可为注射制剂。
79、为了将所述药物组合物制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂(载体)，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油等载体，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等载体。
80、所述药物组合物还可包括细胞冻存液(含二甲基亚砜、氯化钠、人血白蛋白等)。
81、所述药物组合物可用于造血干细胞移植。
82、所述药物组合物可用于减少或避免靶向cll1的car-t疗法中的副作用(脱靶毒性)。
83、本发明还提供了一种预防或治疗cll1靶点相关疾病的方法，所述方法包括向患有cll1靶点相关疾病的受试者施用：
84、(1)靶向cll1的药物；
85、(2)cll1基因敲除的造血干细胞和/或造血祖细胞，或所述药物组合物。
86、所述cll1基因敲除的造血干细胞和/或造血祖细胞含有本文中任一所述的sgrna或所述基因编辑组合物。
87、所述向患有cll1靶点相关疾病的受试者施用cll1基因敲除的造血干细胞和/或造血祖细胞可以在施用靶向cll1的药物的同时、之前或之后。
88、上述方法中，所述cll1基因敲除的造血干细胞和/或造血祖细胞可以是利用本文中任一所述sgrna或所述基因编辑组合物将受体细胞中的cll1基因敲除制备而得。
89、上述方法中，所述靶向cll1的药物可包括靶向cll1的car细胞或抗体。
90、上述方法中，所述靶向cll1的药物可为car-t细胞。
91、上述方法中，所述car-t细胞包括嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列可如seq id no.14所示。
92、上述方法中，所述car-t细胞还可包括嵌合转换受体，所述嵌合转换受体的氨基酸序列可如seq id no.15所示。
93、上述方法中，所述car-t细胞可以是通过将核苷酸序列为seq id no.13的car基因转入t细胞中稳定表达得到。
94、上述方法中，所述cll1靶点相关疾病可为cll1阳性癌症(即表达cll1的癌症)。
95、上述方法中，所述cll1阳性癌症可为急性髓细胞白血病(acute myeloidleukemia，aml)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，mds)或慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia，cml，慢性粒细胞白血病)。
96、上述方法中，所述受试者可为aml患者。
97、上述方法中，所述aml患者可为难治性和/或复发性急性髓细胞白血病(r/r aml)患者。
98、本发明还提供了一种减少或避免aml靶向疗法副作用的方法，所述方法包括在向aml患者施用靶向cll1的药物的同时、之前或之后也施用cll1基因敲除的造血干细胞和/或造血祖细胞，或也施用本文所述药物组合物。
99、进一步地，上述方法中，所述cll1基因敲除的造血干细胞和/或造血祖细胞可以是利用本文中任一所述sgrna或所述基因编辑组合物将受体细胞中的cll1基因敲除制备而得。
100、所述cll1基因敲除的造血干细胞和/或造血祖细胞含有本文中任一所述的sgrna或所述基因编辑组合物。
101、进一步地，上述方法中，所述副作用可以是在向aml患者施用靶向cll1的药物时，所述药物在靶向杀死肿瘤细胞的同时，还杀死了机体中含有和/或表达cll1抗原的正常细胞(如髓系细胞等)。
102、进一步地，上述方法中，所述正常细胞还包括在aml患者进行造血干细胞移植疗法时，输入患者体内的造血干细胞和/或造血祖细胞，及其分化细胞(如髓系细胞、髓系祖细胞、淋巴系细胞、淋巴系祖细胞等)。
103、本文所述产品可包括试剂、制剂、治疗试剂盒、药物和药物组合物等。
104、本文所述细胞或受体细胞可为细胞系或原代细胞。
105、本文所述造血干细胞和/或造血祖细胞可来源于骨髓、脐带血(脐血)、胎盘组织、外周血、动员外周血、诱导的多能干细胞等但不限于此。
106、本文所述细胞、造血干细胞、造血祖细胞、car细胞或car-t细胞可以是自体的，也可以是非自体的(同种异体的、同基因的或异种的)。
107、本文所述细胞、造血干细胞、造血祖细胞、car细胞或car-t细胞可以是自体的或同种异体的。
108、本文所述造血干细胞和/或造血祖细胞可为cd34+细胞。
109、本文所述cll1靶点相关疾病可为cll1阳性癌症(即表达cll1的癌症)。
110、本文所述cll1阳性癌症可为急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，aml)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，mds)或慢性髓细胞白血病(chronicmyeloid leukemia，cml，慢性粒细胞白血病)但不限于此。
111、本文所述急性髓细胞白血病(aml)可为难治性和/或复发性急性髓细胞白血病(r/raml)。
112、本文所述施用的量可为治疗有效量。所述治疗有效量可指(i)治疗或预防特定疾病、病况或障碍；(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状；或(iii)预防或延迟本文中所述的特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状发作的药物的用量。治疗有效量可以通过在已知的体外或体内(例如动物模型)系统中测试而确定。
113、本文所述cll1基因敲除的造血干细胞和/或造血祖细胞可以通过本领域已知的各种方法施用。例如通过静脉内注射或连续输注，或经口、皮内、皮下、肌肉内、心室内或鞘内、腹膜内、动脉内、囊内或胸膜内施用，优选静脉内施用。
114、本文所述受试者可为人类或非人类动物。
115、本文所述非人类动物可为非人类哺乳动物。
116、本文所述非人类哺乳动物可为小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪，犬，羊，猴，兔、猫、牛、马中的任意一种但不限于此。
117、本文所述cll1基因可为内源cll1基因。
118、本发明通过一系列设计、构建和筛选，最终筛选出能够实现高效基因编辑的sgrna，并基于crispr/cas9技术，进一步研究和开发了含有该sgrna的基因编辑系统，并建立了利用该sgrna在体外高效编辑造血干细胞的方法，通过电转染的方式将cas9-grna核糖核蛋白复合体递送进细胞，缩短了rnp在细胞内的持续时间，极大的降低了脱靶效应。本发明公开的sgrna能够靶向并引导cas9蛋白高效切割cll1基因，实验表明，本发明的sgrna能高效、特异和低脱靶的敲除cll1基因，基因编辑效率可以达到77％以上，并且利用本发明sgrna敲除cll1基因后的造血干细胞具有良好的髓系分化功能，同时不影响其分化的髓系细胞的功能，cll1基因敲除的造血干细胞和其分化的髓系细胞均能够有效避免cll1-car-t细胞的杀伤作用，避免了cll1 car-t的毒副作用。体内实验结果进一步表明，利用本发明sgrna敲除cll1基因后的造血干细胞具有较高的、长期的造血重建能力，不仅具有高度的自我更新能力，还具有良好的分化能力。本发明的方法可以用于car-t细胞治疗与造血干细胞移植疗法的联合应用中，能够解决靶向cll1的car-t细胞识别进攻正常髓系细胞产生脱靶毒性的问题，可用于替换aml患者的标准移植治疗，为aml患者带来更高的治愈率，对aml的治疗具有重要的临床价值和应用前景。
119、术语定义
120、在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
121、术语“cas蛋白(也称cas核酸内切酶)”通常是指一系列具有多种活性的核酸内切酶，能在向导rna(guide rna，grna)的引导下对靶位点进行切割。
122、术语“cas9蛋白”通常是指与crrna和tracrrna或与引导rna形成复合物的ii型crispr系统的cas内切核酸酶，用于特异性识别和切割全部或部分的dna靶序列。cas9蛋白具有两个不同的结构域：hnh结构域和ruvc结构域。hnh结构域负责切割与crrna(或grna)互补配对的dna链(靶链)，而ruvc结构域负责切割非互补链(非靶链)。本发明所述cas9蛋白不限于特定的某一种蛋白，只要能与sgrna(grna)配合使用即可。所述cas9蛋白可源自于细菌种类。
123、术语“sgrna(单向导rna，single-guide rna)”通常是指人为地对具有双rna结构的crrna/tracrrna复合物(grna)进行改造，将crrna和tracrrna直接(或通过接头)连接而成的单个rna的结构。sgrna是crispr-cas系统的组成部分，负责引导cas蛋白识别并切割目标核酸分子。在实际基因编辑应用中，sgrna可以直接合成，也可以通过质粒表达或体外转录获得。本领域中，“grna”通常可与“sgrna”互换使用。本文中“grna”和“sgrna”亦可互换使用。
124、术语“识别区序列”也可称为引导序列，通常是指导向rna(sgrna或grna)包含的靶向序列。所述引导序列通常与靶序列具有足够互补性，从而能够与所述靶序列杂交并引导crispr/cas复合物与所述靶序列特异性结合。引导序列与靶序列之间的完全互补是优选的，但一定的错配(如1-6个核苷酸的错配)也是允许的，只要其仍然能够导致cll1基因的敲除。引导序列与其相应靶序列之间的互补程度为至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定两条核酸序列的互补性的方法在本领域普通技术人员的能力范围内。
125、术语“框架区(scaffold)”通常是指导向rna(sgrna或grna)中被cas蛋白识别并结合的序列，也可称为sgrna的骨架序列。scaffold可由本领域技术人员常规选用，例如可以选用cas9所对应的sgrna的骨架序列，也可以是在此基础上构建的一些突变体，这些突变体仍具有结合相应cas9的功能。
126、术语“rnp混合物”也称为“rnp复合物”，通常是指由rna和蛋白质组成的复合体。在本发明中，所述rnp混合物可指cas9/sgrna核糖核蛋白复合物(在本文也称为cas9-grna核糖核蛋白复合体)，其包含两个组分，即sgrna(或grna)和cas9蛋白。
127、术语“同一性”通常是指两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。本文所述同一性可指核苷酸序列的同一性。具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员知晓，可使用国际互联网上的同一性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。此外可以使用序列分析软件(如clc main workbench和megaligntm)进行测定，例如使用缺省参数的计算机程序blast，尤其是blastp或tblastn。本文中，所述90％以上同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的同一性。
128、术语“表达盒”通常是指包含足以表达目的基因的核酸元件的核酸构建体。典型的表达盒包含启动子、mcs(多克隆位点，multiple cloning site)和终止子。表达盒还可以包括目的基因、标记基因(如tk基因、dhfr基因、cat基因和neo基因)核糖体识别和结合位点(sd)、转录因子结合位点(tfbs)、增强子、沉默子、阻遏子、内含子、加poly(a)信号序列和/或mrna剪接信号序列等。表达盒中各元件之间可以直接连接或通过接头间接连接。
129、术语“载体(vector)”通常是指能够把外源dna或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和/或表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得扩增和/或表达。本领域技术人员可以根据基因工程的目的和受体细胞的性质选择合适的载体。所述载体包括但不限于：质粒(plasmid)、噬菌体(phage，如λ噬菌体或m13噬菌体)、黏粒(cosmid，即柯斯质粒)、噬菌粒(phagemid)、穿梭载体(shuttle vector，如酵母表达载体)、ti质粒、人工染色体(如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)、p1人工染色体(pac)或ti质粒人工染色体(tac))、病毒载体(如杆状病毒载体、逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒))。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
130、术语“微生物”通常包括细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体、藻等。例如所述细菌可来自埃希氏菌属(escherichia sp.)(如大肠杆菌)、欧文氏菌属(erwinia sp.)、土壤杆菌属(agrobacterium sp.)(如根癌农杆菌)、黄杆菌属(flavobacteriumsp.)、产碱菌属(alcaligenes sp.)、假单胞菌属(pseudomonas sp.)和芽胞杆菌属(bacillussp.)(如芽孢杆菌)等。所述病毒可包括轮状病毒、杆状病毒、逆转录病毒(如慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒、乳头瘤病毒、流感病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)和疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等。所述真菌可来自酵母菌属(saccharomyces sp.)(如酿酒酵母、甲醇酵母、毕赤酵母)、镰刀菌属(fusarium sp.)、丝核菌属(rhizoctoniasp.)、轮枝菌属(verticillium sp.)、青霉属(penicillium sp.)、曲霉属(aspergillussp.)和头孢霉(cephalosporiumsp.)等。所述放线菌可来自链霉菌属(streptomyces sp.)(如链霉菌)。所述藻可来自蓝藻门(cyanophyta)(如蓝藻)、墨角藻属(fucus sp.)、曲壳藻属(achnanthes sp.)、茧形藻属(amphiprora sp.)、双眉藻属(amphora sp.)、纤维藻属(ankistrodesmus sp.)、星胞藻属(asteromonas sp.)和黄金色藻属(boekelovia sp.)等。
131、术语“宿主细胞”也称为受体细胞，通常是指可用于导入载体的任何类型的细胞，例如植物细胞和动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的，其中：所述植物细胞可为拟南芥(arabidopsis thaliana)、烟草(nicotiana tabacum)、玉米(zea mays)、水稻(oryza sativa)、小麦(triticum aestivum)等植物细胞但不限于此；所述动物细胞可为哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)、中国仓鼠卵巢细胞亚株(cho-k1细胞)、非洲绿猴肾细胞(vero细胞)、sv40转化的非洲绿猴肾细胞(cos细胞)、幼仓鼠肾细胞(bhk细胞)、小鼠乳腺癌细胞(c127细胞)、人胚胎肾细胞(hek293细胞)、人hela细胞、成纤维细胞、骨髓细胞系、t细胞或nk细胞等)、禽类细胞(例如鸡或鸭细胞)、两栖类细胞(例如非洲爪蟾(xenopus laevis)细胞或大鲵(andrias davidianus)细胞)、鱼类细胞(例如草鱼、鲤鱼、虹鳟鱼或鲶鱼细胞)、昆虫细胞(例如sf21细胞或sf-9细胞)等但不限于此。
132、术语“重组载体”通常是指将外源目的基因与载体在体外连接构建而成的重组体dna分子，可以任何合适的方式构建，只要构建的重组载体可携带外源目的基因进入受体细胞、并为外源目的基因提供在受体细胞的复制、整合、扩增和/或表达能力即可。
133、术语“重组微生物”通常是指对目的微生物的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的重组微生物。如将外源目的基因或重组载体导入目的微生物，或直接对目的微生物的内源基因进行基因编辑。
134、术语“重组宿主细胞”通常是指对宿主细胞的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的重组宿主细胞。如将外源目的基因或重组载体导入宿主细胞，或直接对宿主细胞的内源基因进行基因编辑。
135、术语“嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)”通常是指人工构建的融合基因编码的跨膜分子，能引导免疫细胞特异性地追踪识别和清除表达相关靶配体的肿瘤细胞，具有高度靶向性。car的基本结构可以划分为四部分，由细胞外向细胞内方向，分别是胞外肿瘤抗原结合区(简称抗原结合区)、铰链区、跨膜区和胞内信号区。
136、术语“嵌合转换受体(chimeric switch receptor，csr)”通常是指通过基因工程手段，控制被修改的t细胞在受到抑制分子的抑制信号时，转化为激活信号，使t细胞仍然能够在抑制环境中保持攻击力。csr通过识别抑制性受体的配体，从而将原有的免疫抑制性信号转变为免疫活化性信号，激活免疫细胞，提升car-t细胞的抗肿瘤活性。
137、术语“car-t细胞”通常是指表达嵌合抗原受体(car)的t细胞，其可以特异性地识别和杀伤表达被嵌合抗原受体识别的靶抗原的细胞。car-t细胞的定义涵盖t淋巴细胞的所有类别和亚类，包括cd4+t细胞、cd8+t细胞、γδt细胞以及效应t细胞、记忆t细胞、调节性t细胞等。
138、术语“car细胞”通常是指通过分子生物学和基因工程技术，将嵌合抗原受体(car)的基因(car基因)导入免疫效应细胞，将car表达在免疫效应细胞表面，从而获得特异性识别并杀伤靶细胞的一类基因修饰的免疫效应细胞。相对于car-t细胞而言，car细胞不局限于特定的t细胞类型，car细胞可以包括car-t细胞、car-nk细胞、car-nkt细胞、car-γδt细胞、car-巨噬细胞(car-m细胞)、car-ipsc细胞和car-psc细胞等但不限于此。
139、术语“cd34+细胞”通常是指cd34阳性细胞，也称为cd34+造血干细胞。cd34是造血干细胞标志物。常用的造血干细胞标志物还包括cd33、abcg2、ccr2、lin-、c-kit(cd117)、cd133等。利用造血干细胞标志物，通过免疫学方法(例如荧光激活细胞分选技术(facs)、免疫磁珠技术、免疫吸附柱技术、亲和分离技术、panning技术)分离制备造血干细胞是本领域技术人员熟知的。cd34+细胞可通过本领域技术人员已知的任何技术富集/选择。例如，在本发明的一个实施方案中，使用抗人cd34偶联磁珠通过磁珠分选法富集/选择动员外周血中的cd34+细胞。在本发明中，cd34+细胞来源于健康志愿者的动员外周血，通过采用注射动员剂(包括但不限于粒细胞集落刺激因子(g-csf)、普乐沙福(plerixafor)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf))的方法将骨髓血中的造血干细胞动员到外周血中，进一步采集获得动员外周血。cd34+细胞还可以商业购买，也可以从临床样本(如骨髓、脐带血、胎盘组织、外周血、动员外周血)获得。
140、术语“穿膜肽(penetratin)”也称为细胞膜转导肽、细胞穿透肽或内化肽，其功能是促进与其结合的蛋白或多肽被细胞摄取和吸收，即可以将蛋白或多肽带入到细胞内发挥生物学活性。这类物质均为带有正电荷的长短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基，二级结构皆具有α-螺旋的空间构象。
141、术语“内源”通常是指来自生物、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何物质。
142、术语“外源”通常是指从生物、细胞、组织或系统外部引入或在其外部产生的任何物质。
143、术语“自体的”通常是指来自同一受试者的细胞。
144、术语“同种异体的”通常是指与比较中的细胞在遗传上不同的相同物种的细胞。
145、术语“同基因的”通常是指与比较中的细胞在遗传上相同的不同受试者的细胞。
146、术语“异种的”通常是指与比较中的细胞不同物种的细胞。
147、术语“预防”通常是指为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。
148、术语“治疗”通常是指为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。有益或所需的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病范围的缩小、疾病的稳定(即不再恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻以及缓解(不论是部分缓解还是完全缓解)，无论是可检测还是不可检测的。此外，治疗还可以指与受试者未接受治疗时的预期生存期相比延长生存期。
1.sgrna，其特征在于，所述sgrna包括识别区和框架区，所述识别区的核苷酸序列为seq id no.5的第1-20位、seq id no.6的第1-20位或seq id no.7的第1-20位。
2.根据权利要求1所述的sgrna，其特征在于，所述框架区的核苷酸序列为seq id no.4或与seq id no.4限定的核苷酸序列具有90％以上同一性且具有相同功能的序列。
3.根据权利要求1或2所述的sgrna，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seq idno.5、seq id no.6或seq id no.7所示。
4.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
5.一种基因编辑组合物，其特征在于，所述基因编辑组合物包括b1)和b2)：
6.根据权利要求5所述的基因编辑组合物，其特征在于，所述cas蛋白选自cas9、cas12a、cas12b、cas12i3、cas13a、cas13b和cas13c。
7.权利要求1-3中任一所述的sgrna、权利要求4所述的生物材料、或权利要求5或6中所述基因编辑组合物在下述任一项中的用途：
8.一种制备cll1基因敲除的细胞的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1-3中任一所述的sgrna或权利要求5或6中所述的基因编辑组合物将受体细胞中的cll1基因敲除。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述将受体细胞中的cll1基因敲除是通过使所述受体细胞中的cll1基因与权利要求1-3中任一所述的sgrna和cas蛋白接触。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述接触的步骤通过如下d1)和d2)进行：
11.根据权利要求8-10中任一所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
12.根据权利要求8-11中任一所述的方法，其特征在于，所述受体细胞为含有内源cll1基因的细胞、表达cll1抗原的细胞、造血干细胞、造血祖细胞、aml细胞或白血病干细胞。
13.由权利要求8-12中任一所述的方法得到的cll1基因敲除的细胞，所述cll1基因敲除的细胞含有权利要求1-3中任一所述的sgrna或权利要求5或6中所述的基因编辑组合物。
14.权利要求13所述的cll1基因敲除的细胞在制备用于预防或治疗cll1靶点相关疾病的产品中的用途，所述cll1基因敲除的细胞为cll1基因敲除的造血干细胞和/或造血祖细胞。
15.权利要求13所述的cll1基因敲除的细胞与靶向cll1的car细胞联合在制备用于预防或治疗cll1靶点相关疾病的产品中的用途，所述cll1基因敲除的细胞为cll1基因敲除的造血干细胞和/或造血祖细胞。
