本发明涉食品领域，主要涉及一种具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物的制备方法。
背景技术：
1、三七为我国常用大宗药材且被纳入“可用于保健食品名单”，其活性成分有皂苷类、多糖类、黄酮类以及氨基酸类成分。我国每年在三七加工产业化工程中产生大量副产物，传统处理方法不仅会造成资源浪费还会环境污染。
2、研究发现，三七加工副产物中仍残有一定量的多糖类成分、皂苷类、黄酮类等活性成分；还具有丰富的碳源、氮源、无机盐等物质，可为微生物发酵提供所需的营养物质。而益生菌则是被定义为一类对人体有益的活菌，可利用上述物质进行生长、繁殖，代谢，所产生后生元同样具有生物活性；同时益生菌产生的酶可对细胞壁进行降解，有利于三七加工副产物中活性成分的溶出。研究结果表明，益生菌经本方法发酵后，其总多糖、总黄酮的含量显著提高，具有较高的开发研究价值。免疫系统是机体抵御外来病原体的重要系统，当病原微生物入侵宿主时，参与机体非特异性免疫的巨噬细胞合成并分泌趋化因子和细胞因子，增强机体抵抗力。多糖类成分以其多种途径、多靶点对免疫细胞具有良好的激活作用而受到广泛关注。其具有可以增强巨噬细胞吞噬能力，诱导炎症因子(如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、和白细胞介素-6)和炎症介质(如一氧化氮)表达间接杀死病原体，从而参与免疫调节信号通路。益生菌同样具有调节免疫的作用，相关文献报道，乳双歧杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌所制的符合益生菌制剂具有升高免疫低下小鼠血清中免疫球蛋白及细胞因子水平，调节细胞免疫、体液免疫从而发挥增强免疫的作用。
技术实现思路
1、发明目的：本发明的目的在于提供一种具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物。另一目的是提供该组合物的制备方法。
2、技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
3、一种有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物，它包括下列重量份数的原料：三七副产物发酵原料3～9份，可溶性淀粉1～3份，β-环糊精2～5份，甘露醇0.05～0.1份，复合益生菌冻干粉0.006～0.01份。。
4、作为优选方案，以上所述的具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物，它包括下列重量份数的原料：三七加工副产物发酵产物5份，可溶性淀粉2份，β-环糊精3份，甘露醇0.06份，复合益生菌冻干粉0.01份。
5、作为优选方案，以上所述的一种具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物的制备方法，它包括以下步骤：
6、(1)益生菌种子液的制备
7、(2)培养基的制备
8、(3)发酵产物的制备；
9、(4)提取；
10、(5)离心；
11、(6)减压浓缩；
12、(7)真空干燥；
13、(8)原料颗粒的制备；
14、(9)益生菌冻干粉的制备；
15、(10)发酵组合物的制备。
16、作为优选方案，以上所述的具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物的制备方法，步骤(1)所述的益生菌种子液制备方法为：以3～5％接菌量接种至相应液体培养基于37℃下活化24～36h，用接种环蘸取上述菌悬液于固体培养基于37℃静置培养24～36h，挑取单菌落接种于液体培养基继续培养24～36h得菌悬液；取上述菌悬液于3500～5000rpm下离心10min，弃上清，用无菌水冲洗3遍，摇匀，，用无菌水稀释，即得益生菌种子液；
17、步骤(2)所述的培养基制备方法为：将三七醇提取后的副产物药渣粉碎，过筛，于高温下下蒸汽灭菌，以料液比0.08～0.14g/ml加入无菌水，即得；
18、步骤(3)所述的发酵产物制备方法为：取步骤(2)料液比0.14g/ml的培养基，接种复合益生菌；发酵温度33～35℃；发酵时间为有氧发酵48～72h、厌氧发酵24～36h；
19、步骤(4)所述的提取方法为：取步骤(3)的发酵产物，加8～10倍量纯水超声提取1～3次，每次0.5～1.5h；
20、步骤(5)所述的离心方法为：取步骤(4)中提取液于3500～5000rpm下离心10min；
21、步骤(6)所述的减压浓缩方法为：取步骤(5)离心上清液，70～80℃减压浓缩，得浓缩液；
22、步骤(7)所述的干燥方法为：取步骤(6)浓缩液于70～80℃真空干燥，得发酵产物干膏粉；
23、步骤(8)所述的原料颗粒的制备方法为：将发酵产物干膏粉5份，可溶性淀粉2份，β-环糊精3份充分混合后，加入乙醇为润湿剂制软材，过筛制粒，整粒，鼓风干燥，即得；
24、步骤(9)益生菌冻干粉的制备方法为嗜热链球菌、两歧双歧杆菌及嗜酸乳杆菌离心后，以活菌数比例为2：3：1复配，加入冻干保护剂，经冷冻干燥，粉碎，过筛即得；
25、步骤(10)所述的制备方法为：以原料颗粒10～20份，甘露醇0.06～0.1份，益生菌冻干粉0.01～0.03份，充分混合即得。
26、作为优选方案，以上所述的具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物的制备方法，步骤(3)的方法为：料液比0.14g/ml的培养基，复合益生菌接种量为5％，复合益生菌配比为嗜热链球菌：两歧双歧杆菌：嗜酸乳杆菌为2：3：1；发酵温度33℃；发酵时间为有氧发酵48h、厌氧发酵36h。
27、作为优选方案，以上所述的具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物的制备方法，步骤(6)所述的减压浓缩方法为：取步骤(5)离心液，70℃减压浓缩，得浓缩液；
28、步骤(7)所述的干燥方法为：取步骤(6)浓缩液于70℃真空干燥，得发酵产物干膏粉。
29、作为优选方案，以上所述的具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物的制备方法，步骤(8)所述的制备方法为：将发酵产物干膏粉5份，可溶性淀粉2份，β-环糊精3份充分混合后，加入75％乙醇为润湿剂制软材，过筛制粒，整粒，60℃鼓风干燥，即得。
30、作为优选方案，以上所述的的具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物的制备方法，步骤(9)所述的冻干保护剂配方为脱脂乳0.8g/ml；蔗糖0.6g/ml；甘油0.3g/ml；抗坏血酸钠0.3g/ml。
31、作为优选方案，以上所述的的具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物的制备方法，步骤(10)所述的制备方法为：以原料颗粒10份，甘露醇0.06份，益生菌冻干粉0.01份，充分混合即得。
32、作为进一步优选方案，本发明提供的一种具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物的制备方法，包括以下步骤：
33、步骤(1)：益生菌种子液制备方法为：分别以5％接菌量将嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌接种至相应液体培养基于37℃下活化24h，用接种环蘸取上述菌悬液于固体培养基37℃静置培养24h，挑取单菌落接种于液体培养基继续培养36h得菌悬液；取上述菌悬液于5000rpm下离心10min，弃上清，用无菌水冲洗3遍，摇匀，用无菌水稀释，即得益生菌种子液；
34、步骤(2)：培养基制备方法为：将三七醇提取后的副产物药渣粉碎，过筛，于高温下蒸汽灭菌，以料液比0.14g/ml加入无菌水，即得；
35、步骤(3)：发酵产物制备方法为：取步骤(2)料液比0.14g/ml的培养基，复合益生菌接种量为5％，复合益生菌配比为嗜热链球菌：两歧双歧杆菌：嗜酸乳杆菌为2：3：1；发酵温度33℃；发酵时间为有氧发酵48h、厌氧发酵36h，得三七发酵产物。
36、步骤(4)：提取方法为：取步骤(3)的三七发酵产物，加10倍量纯水超声提取2次，每次1.5h；
37、步骤(5)：取步骤(4)超声提取的溶液，于5000rpm下离心10min，上清液即为离心液；
38、步骤(6)：减压浓缩方法为：取步(5)离心液，70℃减压浓缩，得浓缩液；
39、步骤(7)：干燥方法为：取步骤(6)浓缩液在70℃真空干燥，得发酵产物干膏粉；
40、步骤(8)：原料颗粒的制备方法为：将步骤(7)发酵产物干膏粉5份，可溶性淀粉2份，β-环糊精3份充分混合后，加入75％乙醇为润湿剂制软材，过筛制粒，整粒，60℃鼓风干燥，即得原料颗粒。
41、步骤(9)：益生菌冻干粉的制备方法为：蒋步骤(1)嗜热链球菌、两歧双歧杆菌及嗜酸乳杆菌离心后，以活菌数比例为2：3：1复配，加入冻干保护剂(冻干保护剂配方为脱脂乳0.8g/ml；蔗糖0.6g/ml；甘油0.3g/ml；抗坏血酸钠0.3g/ml)，经冷冻干燥，粉碎，过筛即得；
42、步骤(10)复合益生菌发酵组合物的制备方法为：以步骤(8)原料颗粒10份，甘露醇0.06份，步骤(9)的益生菌冻干粉0.01份，充分混合即得。
43、作为优选方案，以上所述的制剂为口服制剂包括颗粒剂、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、汤剂、散剂、滴丸剂、口服液体制剂。
44、本发明所述的三七加工副产物可为三七醇提或水提后的三七药渣。
45、本发明提供的具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物，通过现代仪器分析方法表明了经本方法发酵，三七加工副产物多糖类、皂苷类成分的含量显著提高；通过动物模型实验结果表明：本发明提供的组合物具有减缓免疫低下小鼠体质量下降的特点，可有效回调免疫低下小鼠免疫器官指数，可有效回调免疫低下小鼠血清中免疫球蛋白和细胞因子水平，可有效回调免疫低下小鼠全血中白细胞、淋巴细胞及中细粒细胞的水平。
46、上述研究表明本发明提供的益生菌对免疫低下小鼠各免疫指标均有显著的改善作用，实验过程中并未发现明显的毒副作用，并未出现小鼠死亡现象，表明本发明安全性良好，可用于制备具有增强免疫作用的功能性产品。
1.一种具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物，其特征在于，它包括下列重量份数的原料：三七加工副产物发酵产物3～9份，可溶性淀粉1～3份，β-环糊精2～5份，甘露醇0.05～0.1份，复合益生菌冻干粉0.006～0.01份。
2.根据权利要求1所述的具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物，其特征在于，它包括下列重量份数的原料：三七加工副产物发酵产物5份，可溶性淀粉2份，β-环糊精3份，甘露醇0.06份，复合益生菌冻干粉0.01份。
3.根据权利要求1或2所述的具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物的制备方法，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)的方法为：料液比0.14g/ml的培养基，复合益生菌接种量为5％，复合益生菌配比为嗜热链球菌：两歧双歧杆菌：嗜酸乳杆菌为2：3：1；发酵温度33℃；发酵时间为有氧发酵48h、厌氧发酵36h。
6.根据权利要求4所述的具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述的减压浓缩方法为：取步骤(5)离心液，70℃减压浓缩，得浓缩液；
7.根据权利要求4所述的的具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物的制备方法，其特征在于，步骤(9)所述的冻干保护剂配方为脱脂乳0.8g/ml；蔗糖0.6g/ml；甘油0.3g/ml；抗坏血酸钠0.3g/ml。
8.根据权利要求4所述的的具有增强免疫作用的复合益生菌发酵组合物的制备方法，其特征在于，步骤(10)所述的制备方法为：以原料颗粒10份，甘露醇0.06份，益生菌冻干粉0.01份，充分混合即得。
9.权利要求1或2所述的复合益生菌发酵组合物在制备增强免疫功能的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，将复合益生菌发酵组合物与药学上可接受的载体制备成颗粒剂、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、汤剂、散剂、滴丸剂、口服液体制剂。
