本发明属于蛋白工程，涉及一种开关式穿膜肽重组去皱蛋白组合套装及其应用。
背景技术：
1、肉毒毒素(botulinum toxin，bont)是已知微生物毒素中毒性最强的物质，其对人类的致死量为0.1～1.0μg,相当于3 000～30 000只小鼠半致死量(lethal dose,50％,ld50)，其可以经消化道吸收进入血液循环及淋巴循环(例如:食物源性肉毒中毒和婴儿肉毒中毒)，也可以通过伤口直接进入血液循环(例如:创伤肉毒中毒)。
2、a型肉毒素，其商用通用名为注射用a型肉毒素，是一种细菌外毒素，它可以阻断神经和肌肉之间的传递，使过度收缩的肌肉达到松弛从而除皱的效果，在医疗美容市场上应用广泛。目前市售的注射用a型肉毒素的活性药用成分为a型肉毒毒素复合物，以肉毒毒素复合体形式存在，由a型肉毒神经毒素(150kd)、血凝素蛋白(ha)和非毒素非血凝素蛋白(ntnh)通过非共价键组成的复合物，存在于天然肉毒梭菌的厌氧发酵培养基中，通过一系列提取沉淀等工艺纯化得到肉毒神经毒素(主要作用成分)。其中，起主要临床作用的为a型肉毒素神经毒素(bont/a)，其由一条分子量为50kda的轻链和分子量为100kda的重链通过一对二硫键连接构成。
3、根据文献报道，目前，市售肉毒毒素均通过发酵培养天然肉毒梭菌，随后再进行一系列复杂的分离和纯化手段来生产肉毒素的，这种方式复杂危险，工艺成本高且蛋白产量低。因此异源表达系统允许使用简单安全的培养基，工艺安全性提高，生产工艺也能得到简化，从而使大规模工业生产肉毒素成为可能。
4、然而，构建全功能重组bont并非易事，专利(wo0012728)报道了以大肠杆菌作为底盘菌株，诱导表达全功能重组bont/a的方法，使得肉毒素神经毒素蛋白表达量占总蛋白质的6％-35％范围内，但是，其产品缺乏成熟的二硫键结构，因而无法发挥天然梭菌肉毒素神经毒素特异性切割与突触相关的膜蛋白而阻断神经递质的功效，且表达量低，无法实现工业化生产，而且即使是纯化后的全长肉毒素，毒性和致死率仍然很高，对人的半致死量为40.1u/kg，其毒性相当于等量氰化钾的一万倍。
5、因此，目前亟需研究开发一种较低免疫原性，安全高效，且易于表达生产的注射用去皱重组蛋白(活性成分为a型肉毒素轻链)。
技术实现思路
1、本发明的目的之一在于针对现有a型肉毒素存在的问题提供一种穿膜肽，其能够引导轻链穿透神经细胞进入细胞质。
2、本发明的目的之二在于提供一种穿膜肽重组蛋白，其具有成熟的二硫键结构，安全高效，易于表达生产，且可以实现产品的低免疫原性，患者可以避免因多次使用产品导致的效力降低的可能性。
3、本发明的目的之三在于提供一种开关式穿膜肽重组去皱蛋白组合套装，在不额外添加穿膜肽的时候，可以使患者安全的接触，生产者安全地进行生产；当注射使用(额外添加穿膜肽)的时候才具有较高的穿膜活性。
4、为此，本发明第一方面提供了一种穿膜肽，其能够引导轻链穿透神经细胞进入细胞质，其氨基酸残基≤30，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
5、本发明第二方面提供了一种穿膜肽重组蛋白，其为以下蛋白质中的任意一种：
6、(a1)由如本发明第一方面所述的穿膜肽连接于肉毒素轻链蛋白的n端或c端构成的蛋白质；
7、(a2)在(a1)所限定的蛋白质的c端和/或n端连接标签后得到的融合蛋白。
8、优选地，所述肉毒素轻链蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
9、优选地，所述标签为6his亲和标签。
10、本发明第三方面提供了一种产如本发明第二方面所述的穿膜肽重组蛋白的重组基因工程菌的构建方法，其包括将编码如本发明第一方面所述的穿膜肽的核苷酸分子的序列通过添加linker序列融合于编码肉毒素轻链蛋白的肉毒素轻链基因的核苷酸分子序列的3′端或5′端，以及任选的在编码肉毒素轻链蛋白的肉毒素轻链基因的核苷酸分子序列的5′端或3′端连接6his标签，然后在宿主细胞中表达，获得产如本发明第二方面所述的穿膜肽重组蛋白的重组基因工程菌。
11、优选地，所述编码穿膜肽的核苷酸分子的序列如seq id no.2所示。
12、优选地，所述编码所述肉毒素轻链蛋白的肉毒素轻链基因的核苷酸序列如seq idno.4所示。
13、优选地，所述linker序列为ggggs或(ggggs)n。
14、本发明第四方面提供了如本发明第二方面所述的穿膜肽重组蛋白或由如本发明第三方面所述的构建方法构建的重组基因工程菌制得的穿膜肽重组蛋白在制备肉毒素产品中的应用。
15、本发明第五方面提供了一种开关式穿膜肽重组去皱蛋白组合套装，其由如本发明第一方面所述的穿膜肽和如本发明第二方面所述的穿膜肽重组蛋白组成。
16、本发明第六方面提供了如本发明第五方面所述的开关式穿膜肽重组去皱蛋白组合套装在制备开关式穿膜肽重组去皱蛋白组合制剂中的应用。
17、在本发明的一些实施例中，所述开关式穿膜肽重组去皱蛋白组合制剂为注射制剂；优选地，所述穿膜肽的浓度为10-50μm。
18、在本发明的一些实施例中，所述开关式穿膜肽重组去皱蛋白组合制剂为外用制剂；优选地，所述穿膜肽的浓度为10-50μm。
19、本发明通过大量前期神经细胞穿膜实验，筛选获得一种可以有效引导轻链穿透神经细胞进入细胞质的穿膜肽。其中，穿膜肽与肉毒素轻链通过基因重组方式获得穿膜肽重组轻链蛋白，相较于全长肉毒素更易表达。由于所述重组蛋白分子内不含有血凝素等复合物蛋白，因此可以实现产品的低免疫原性，患者可以避免因多次使用产品导致的效力降低的可能性。
1.一种穿膜肽，其能够引导轻链穿透神经细胞进入细胞质，其氨基酸残基≤30，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种穿膜肽重组蛋白，其为以下蛋白质中的任意一种：
3.根据权利要求2所述的穿膜肽重组蛋白，其特征在于，所述肉毒素轻链蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
4.根据权利要求2或3所述的穿膜肽重组蛋白，其特征在于，所述标签为6his亲和标签。
5.一种产如权利要求2-4中任意一项所述的穿膜肽重组蛋白的重组基因工程菌的构建方法，其包括将编码如权利要求1所述的穿膜肽的核苷酸分子的序列通过添加linker序列融合于编码肉毒素轻链蛋白的肉毒素轻链基因的核苷酸分子序列的3′端或5′端，以及任选的在编码肉毒素轻链蛋白的肉毒素轻链基因的核苷酸分子序列的5′端或3′端连接6his标签，然后在宿主细胞中表达，获得产如权利要求2-4中任意一项所述的穿膜肽重组蛋白的重组基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述编码穿膜肽的核苷酸分子的序列如seq id no.2所示；所述编码所述肉毒素轻链蛋白的肉毒素轻链基因的核苷酸序列如seqid no.4所示；和/或，所述linker序列为ggggs或(ggggs)n。
7.根据权利要求2-4中任意一项所述的穿膜肽重组蛋白或由权利要求5或6所述的构建方法构建的重组基因工程菌制得的穿膜肽重组蛋白在制备肉毒素产品中的应用。
8.一种开关式穿膜肽重组去皱蛋白组合套装，其由如权利要求1所述的穿膜肽和如权利要求2-4中任意一项所述的穿膜肽重组蛋白组成。
9.如权利要求8所述的开关式穿膜肽重组去皱蛋白组合套装在制备开关式穿膜肽重组去皱蛋白组合制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，
