本发明涉及体外诊断领域，特别涉及一种筛选杂交瘤细胞株的方法。
背景技术：
1、体外诊断试剂中，无论是基于胶乳比浊法、胶乳增强免疫比浊法的生化试剂，还是基于胶体金层析、荧光免疫层析、酶联免疫吸附还是化学发光方法学的免疫试剂，绝大部分核心原料都离不开单克隆抗体尤其是小鼠单克隆抗体的使用。传统的小鼠单克隆抗体的制备大多都采用酶联免疫吸附技术(elisa)，通过筛选阳性杂交瘤细胞来制备单克隆抗体。
2、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay elisa)是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本原理是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的elisa法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异性抗体。在制备单克隆抗体过程中，筛选阳性杂交瘤细胞株常用的方法是间接法。将抗原预先包被至酶标板上，加入杂交瘤细胞上清(抗体)发生反应，洗去未结合的抗体后加入酶标二抗，洗涤后加入显色剂，通过酶与特定底物的显色反应半定量检测抗体的含量。然而，elisa方法操作过程繁琐、耗时较长(通常为1-2天)，对包被所用抗原的纯度要求较高(80％以上)，否则易与杂交瘤上清中其他杂蛋白发生反应，产生非特异性结合而导致假阳性；此外elisa实验步骤复杂，干扰因素较多，进一步增加了假阳性的风险，使得后续细胞克隆、动物免疫及抗体生产的工作量大大增加。因此，本领域亟需开发一种新的杂交瘤细胞筛选方法，简化实验流程工序和节约时间，并杜绝假阳性细胞株的入选。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种筛选杂交瘤细胞株的方法。
2、本发明的另一目的在于提供一种筛选pg i阳性杂交瘤细胞株的方法。
3、本发明的另一目的在于提供一种筛选myo阳性杂交瘤细胞株的方法。
4、为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供了一种筛选杂交瘤细胞株的方法，所述方法包括步骤：
5、s1，使用表面包被有能够捕获杂交瘤上清的蛋白的传感器处理酶标阳性杂交瘤细胞上清，得到固化有杂交瘤细胞上清的传感器；
6、s2，使用目标抗原结合所述固化有杂交瘤细胞上清的传感器；
7、s3，根据所述目标抗原和所述传感器上所固化的杂交瘤细胞上清的亲和力筛选所述杂交瘤细胞。
8、在一些优选的方案中，所述目标抗原和所述传感器上所固化的杂交瘤细胞上清的亲和力通过所述目标抗原和所述杂交瘤细胞上清之间的结合信号和解离信号获得。优选地，所述目标抗原和所述传感器上所固化的杂交瘤细胞上清的亲和力kd为所述目标抗原和所述杂交瘤细胞上清的解离常数kdis和结合常数kon之比。
9、在一些优选的方案中，所述结合信号/结合常数kon通过使用目标抗原结合所述固化有杂交瘤细胞上清的传感器获得。
10、在一些优选的方案中，所述解离信号/解离常数kdis通过使用平衡液处理所述经目标抗原结合的固化有杂交瘤细胞上清的传感器获得。
11、在一些优选的方案中，所述方法基于生物层干涉技术。
12、在一些优选的方案中，所述方法使用octet分子互作仪进行，所述方法包括步骤：
13、s01，使用表面包被有能够捕获杂交瘤上清的蛋白的传感器处理酶标阳性杂交瘤细胞上清，将所述杂交瘤细胞上清固化在所述传感器上，得到固化有杂交瘤细胞上清的传感器；
14、s02，使用目标抗原结合所述固化有杂交瘤细胞上清的传感器，并采集结合信号；
15、s03，使用平衡液处理步骤s03中经目标抗原结合的固化有杂交瘤细胞上清的传感器，采集解离信号；
16、s04，根据所述结合信号和所述解离信号筛选所述杂交瘤细胞。
17、在一些优选的方案中，步骤s01中，所述酶标阳性杂交瘤细胞的制备包括步骤：使用目标抗原免疫bal b/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与对数期的小鼠骨髓瘤细胞sp2/0进行细胞融合，得到融合细胞，在包被有目标抗原的酶标板上孵育融合细胞的上清，使用酶标仪筛选阳性上清，分泌阳性上清的融合细胞即为阳性杂交瘤细胞。
18、在一些优选的方案中，步骤s01中，所述能够捕获杂交瘤细胞上清的蛋白选自抗小鼠igg-fc抗体、抗小鼠igg抗体、protein a、protein g中至少一种。更为优选地，所述能够捕获杂交瘤细胞上清的蛋白选自抗小鼠igg-fc抗体。
19、在一些优选的方案中，步骤s01中，使用表面包被有能够捕获杂交瘤细胞上清的蛋白的传感器处理酶标阳性杂交瘤细胞上清，使所述杂交瘤细胞上清与所述能够捕获杂交瘤细胞上清的蛋白接触并发生反应。
20、在一些优选的方案中，步骤s01中，所述反应进行时采集固化信号，直至固化信号饱和。
21、在一些优选的方案中，步骤s01中，所述反应结束后，还包括平衡传感器的步骤：待所述固化信号饱和后，洗去所述传感器上固化不牢固的抗体。
22、在一些优选的方案中，步骤s02中，将所述固化有杂交瘤细胞上清的传感器浸入含有所述目标抗原的溶液进行反应，同时采集结合信号。
23、在一些优选的方案中，步骤s03中，待结合信号达到饱和，将所述传感器浸入平衡液中进行解离，同时采集解离信号。
24、在一些优选的方案中，步骤s02中，所述目标抗原的溶液中，所述目标抗原的浓度为50-500nm。更优选地，所述目标抗原的浓度为50-200nm。更优选地，所述目标抗原的溶液为目标抗原的pbst溶液。更优选地，使用0.02％ pbst作为溶剂配制目标抗原的溶液。
25、在一些优选的方案中，所述平衡液为0.02％ pbst。
26、在一些优选的方案中，所述传感器为amc(anti-mouse fc)、amq、protein a、protein g传感器中至少一种。
27、在一些优选的方案中，所述目标抗原选自pg i或myo或其他抗原中至少一种。
28、本发明的第二方面，提供了一种筛选pg i阳性杂交瘤细胞的方法，所述方法包括步骤：
29、s1，使用表面包被有能够捕获pg i杂交瘤上清的蛋白的传感器处理pg i酶标阳性杂交瘤细胞上清，得到固化有pg i杂交瘤细胞上清的传感器；
30、s2，使用pg i抗原结合所述固化有pg i杂交瘤细胞上清的传感器；
31、s3，根据所述pg i抗原和所述传感器上所固化的pg i杂交瘤细胞上清的亲和力筛选所述pg i阳性杂交瘤细胞。
32、在一些优选的方案中，步骤s3中，当所述pg i抗原和所述传感器上所固化的pg i杂交瘤细胞上清的亲和力kd为小于2.66×10-8m时(更优选为10-12至2.66×10-8m)时，将所述pg i阳性杂交瘤细胞筛选入库。
33、本发明的第三方面，提供了一种筛选myo阳性杂交瘤细胞的方法，所述方法包括步骤：
34、s1，使用表面包被有能够捕获myo杂交瘤细胞上清的蛋白的传感器处理myo酶标阳性杂交瘤细胞上清，得到固化有myo杂交瘤细胞上清的传感器；
35、s2，使用myo抗原结合所述固化有myo杂交瘤细胞上清的传感器；
36、s3，根据所述myo抗原和所述传感器上所固化的myo杂交瘤细胞上清的亲和力筛选所述myo阳性杂交瘤细胞。
37、在一些优选的方案中，步骤s3中，当所述myo抗原和所述传感器上所固化的myo杂交瘤细胞上清的亲和力kd为小于2.29×10-7m时(更优选为10-12至2.29×10-7m)时，将所述myo阳性杂交瘤细胞筛选入库。
38、本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优势：
39、(1)本发明首次将生物层干涉(bli)技术用于杂交瘤细胞株的筛选，并开发了基于生物层干涉技术的杂交瘤细胞株筛选方法，该方法不仅灵敏度高(光电信号采集)、准确度好，还能很好地解决杂交瘤细胞株筛选过程中的假阴性假阳性问题(特异性好)。此外，本发明方法通量较高(约50株/panel)，耗时较短(约20min/次)，能直观地观测到杂交瘤细胞株所产单克隆抗体的结合解离等动力学性能，可实现定量检测。
40、(2)本发明的方法固化杂交瘤上清抗体的传感器表面包被有能与小鼠抗体igg结合的蛋白，可以是特异的抗小鼠igg-fc抗体、抗小鼠igg抗体，也可以是非特异的proteina、protein g蛋白，其对应的传感器分别为amc、amq、protein a、protein g传感器，本发明优选amc传感器，其表面包被有抗小鼠igg-fc特异性抗体，捕获的是鼠igg-fc区，不会对抗原结合区fv产生干扰，且结合物抗原为游离态，可充分暴露抗原表位，避免了elisa方法中因抗原包被带来的表位覆盖，同时降低了漏筛的风险。
41、(3)本发明的方法没有标记洗涤步骤(spr技术需要抗原偶联芯片)，简单快速方便；实时采集数据，可实现对分子间瞬时相互作用的检测。
42、(5)本发明的方法为精细定量化分析，通过结合、解离常数等数据可以获得抗体更多的生物学信息，同时适用于检测弱结合快解离反应。
43、(6)相较于spr技术用于杂交瘤细胞株筛选，本发明的方法无管路系统、不会堵塞管路，对样品纯度没有太多要求，更适合体外诊断中杂交瘤上清、血清、血浆、尿液等复杂样品的检测分析。
44、应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
1.一种筛选杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标抗原和所述传感器上所固化的杂交瘤细胞上清的亲和力通过所述目标抗原和所述杂交瘤细胞上清之间的结合信号和解离信号获得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述结合信号通过使用目标抗原结合所述固化有杂交瘤细胞上清的传感器获得；
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法通过使用octet分子互作仪进行，所述方法包括步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s01中，所述能够捕获杂交瘤细胞上清的蛋白选自抗小鼠igg-fc抗体、抗小鼠igg抗体、protein a、protein g中至少一种。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s01中，使用表面有能够捕获杂交瘤细胞上清的蛋白的传感器处理酶标阳性杂交瘤细胞上清，使所述杂交瘤细胞上清与所述能够捕获杂交瘤细胞上清的蛋白接触并发生反应。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s02中，将所述固化有杂交瘤细胞上清的传感器浸入含有所述目标抗原的溶液进行反应，同时采集结合信号；
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s02中，所述目标抗原的溶液中，所述目标抗原的浓度为50-500nm。
9.一种筛选pg i阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
10.一种筛选myo阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
