本发明属于医疗器械，涉及淋巴水肿引流及淋巴系统再生重建治疗，具体涉及一种用于淋巴水肿引流及淋巴系统再生重建的多通道分支化网络支架制备方法。
背景技术：
1、淋巴系统是组织液回流入血的重要通路，也是机体第二大循环系统。若淋巴脉管系统受损、淋巴引流通路异常阻断将导致淋巴水肿(又称为获得性(继发性)淋巴水肿)，进而导致淋巴系统功能受损。由于淋巴系统的功能受损，蛋白质、细胞碎片和液体在局部组织中积聚，会出现患处肿大、皮肤象皮样变等症状，可发生于四肢、头颈、阴囊等部位。淋巴水肿是一种长期性疾病，常继发局部炎症、感染，严重的甚至造成患者败血症、休克及死亡。因此，淋巴水肿不仅影响外形美观，更对患者造成了运动功能损害和心理负担，对患者健康造成严重影响[1,2]。目前世界范围内淋巴水肿患病率高达1.3-1.5/1000[3]，仅在我国患病人数就超过200万人。近年来恶性肿瘤根治术后淋巴系统的破坏所致的继发性淋巴水肿是发病的主要因素，主要继发于乳腺癌根治术后(女性恶性肿瘤第1位)，发病率高达20％-60％[4-6]。综上所述，淋巴水肿因其高发病率及严重的临床表现，是整形外科一大亟待解决的临床难题。
2、针对淋巴水肿中淋巴系统受损、淋巴液回流受阻，最终引起局部液体肿胀、脂质沉积、组织纤维化的临床特点，针对淋巴水肿的治疗主要围绕对症治疗(组织减容)及对因治疗(通过促进淋巴管新生、建立旁路回流等方式促进淋巴液回流)展开。目前，临床所用方法主要分为保守治疗与手术治疗。保守治疗主要包括手法引流、加压治疗、烘绑疗法等，手术治疗则包括组织剥离的减容手术和淋巴循环重建性手术，前者主要是切除病变组织和皮肤、而后者以恢复淋巴引流为目标。然而，目前尚没有标准化的治疗方案，现有的治疗手段也存在各种各样的问题：保守治疗方法表现出治疗过程缓慢而复杂、治疗周期长、疗效不明显的缺点。手术治疗往往疗效不一，且手术损伤大，副作用较大。此外，由于淋巴系统管径较细，手术操作难度较高，对术者要求较高。因此，目前整体而言尚无合适的淋巴水肿治疗方式，亟需提出创伤更小、操作更简便、效果更优的临床替代治疗。
3、针对淋巴水肿，如何快速、有效重建淋巴回流是主要的治疗目标。目前存在的淋巴水肿治疗方式存在着操作技术难度大、副作用大、复发风险高等问题。此外，帮助淋巴回流网络重建的组织来源也是一大问题，供区选择有限、供区损伤大等问题严重限制了目前淋巴治疗的开展。随着组织工程和再生医学的发展，淋巴组织工程技术为重建正常的淋巴网络提供了新方案。利用联通支架来吻合淋巴管之间的间隙并可引导功能性淋巴组织的再生，组织工程技术的发展让其成为可能。
4、目前研究的淋巴组织工程支架集中在其材料及结构的设计和选择上。在材料的选择上，包括天然材料和合成高分子材料。天然材料包括脱细胞基质、胶原等，具有良好的生物相容性，但力学性能较差且降解速率较快。合成高分子材料包括聚己内酯(pcl)、聚乙醇酸(polyglycolic acid，pga)等，其具有良好的力学性能，但生物活性相对较差。在支架结构设计上，目前大部分是单只或者单通道结构，只能与两端淋巴管或者淋巴结产生局部连接，其联通和引流作用收到限制。
5、脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix,adm)是由真皮组织通过一系列物理、化学及生物的方法制备而得的胶原聚集体，这种支架本身带有血管生化结构，所以其在组织工程血管移植重建中得到了广泛的应用。wong[7]等将adm作为皮瓣植入大鼠浅上腹壁并进行观察发现，实验组体内的lec增殖了4倍，lec在14d内稳定增加，在第14天趋于成熟稳定。由此可见，adm对生成淋巴网络具有促进作用。cherubino[8]等在adm生成淋巴管评估的报道中指出，在大鼠实验中，经过28d的观察，应用adm的实验组lec比对照组发育更好。这项研究表明adm支架在一定程度上可以促进lec增殖，并促进淋巴网络再生。由于其是动物来源的生物制品，目前仍存在有毒物质残留、降解速率不可控、非自体疾病传播风险、难以标准化质量控制等问题。
6、淋巴组织工程方法旨在结合相关的细胞和支架成分以再生淋巴结构，以消除淋巴结供体部位发病风险的手术治疗的潜在替代方案。有趣的是，历史上一直使用各种支架来实现淋巴水肿患者的淋巴重建。handley是第一个提出在患处以皮下方式放置无菌丝线的人，通过毛细血管作用促进淋巴流出[9]；后来，silver和puckett1976在他们的临床试验中用一种特殊的特氟龙复丝材料代替了丝线[10]。相关结果显示，这些方法最初引流效果显著，提示淋巴通路支架引流是一种可行的治疗方式，然而生物相容性低的支架长期所致的异物反应会引起淋巴流量减少和局部感染。
7、近期，生物材料的发展使得此类治疗有了更多可能。多丝纳米纤维胶原支架是近期新提出的用于淋巴回流重建的生物材料桥[11～17]，研究结果表明，此类纳米纤维支架可以提供内皮细胞排列生长的空间；同时该支架可为内皮细胞排列和沿胶原纤维迁移提供底物，此外，这些多腔支架可为促进细胞外液回流提供通道，此类生物支架的植入可能通过促进淋巴管新生及促进引流两方面实现治疗效果。该项技术的转化产品已申报相关专利2项(wo2008131293、wo2010019625)，并已作为市售产品上市。此方法首次提出生物材料桥接引流解决淋巴水肿难题，解决了早期材料引流所致的生物相容性低导致的炎症反应，为淋巴水肿的治疗开拓了新思路。然而，由于胶原材料降解周期短，无法提供长期支撑，在降解周期内无法实现完全组织再生，加速了复发可能。此外，单支单束材料，针对病灶缺损补足位置定位难，使用难度高。
8、目前淋巴水肿的治疗仍处于探索阶段，尚无统一的治疗方案，仍是医学界的一大挑战。虽然传统的物理方法和显微外科手术能在一定程度上控制淋巴水肿的症状，但目前仍没有有效的办法进行根除性治疗。随着组织工程和再生医学的发展为重建正常的淋巴网络提供了新思路，但仍缺乏相关的产品。因此，在淋巴缺损治疗领域，急需一种淋巴组织工程再生修复支架材料，使其具有如下四个特点：①具有三维多分支网络结构，可以同时实现短期快速引流以及促进长期淋巴新生的作用；②具有较好的生物相容性，减轻局部炎症反应所导致的淋巴回流异常；③可进一步负载特定生物活性成分如药物、因子等引导功能性淋巴组织的再生；④可以方便的与脂肪干细胞或其他干细胞结合形成淋巴组织工程移植物。
技术实现思路
1、本发明基于上述问题进行，提供了一种适用于淋巴水肿引流及淋巴系统再生重建的多通道分支化网络支架制备方法。该支架以3d打印的三维蔗糖模版为基体，以pcl或pcl-明胶作为修复支架材料，制备phms支架；而后在phms支架上负载促淋巴管新生因子。
2、为了实现上述目的，本发明采用的具体技术方案如下：
3、本发明的第一方面，提供了一种多通道分支化网络支架制备方法，包括如下步骤：
4、a、phms支架构建
5、3d打印多层焦糖基模板后，配置质量体积浓度为4％的pcl-hfip溶液或pcl-明胶-hfip溶液(pcl和明胶之间的质量比为9:1)；将焦糖基模板完全浸入混合溶液中，在模板周围形成了一层薄薄的混合层，并在溶剂hfip蒸发过程中液相分离产生微孔，获得糖模复合体；然后水溶去除焦糖基模板，最后在真空中冷冻干燥支架，制备phms支架；
6、b、功效因子负载
7、配置具有促淋巴管新生或抑制淋巴损伤相关炎症功效的因子、药物溶液，将phms支架浸泡其中，4℃避光孵育24h，孵育结束后对负载效果进行检测。
8、优选的，促淋巴管新生、抑制淋巴损伤相关炎症等功效因子为具有改善淋巴损伤、促进淋巴修复的生长因子及小分子药物。所述小分子药物选自他克莫司、酮洛芬、乌苯美司中的任意一种或多种，所述生长因子选自vegf-c、ang-2、fgfs、thromboxane中的任意一种或多种。
9、本发明具体实施方式部分中，以vegf-c为例，对促淋巴管新生因子的负载以及效果进行验证。vegf-c溶液浓度为1.5-2μg/ml，为了实现负载效果检测，溶液中还含有荧光标签分子fitc。phms-vegf-c支架植入后可稳定向周围组织释放vegf-c活性因子，显著改善组织局部vegf-c浓度，从而促进局部淋巴组织的新生以及缺损淋巴组织的修复。
10、优选的，步骤a中，多层焦糖基模板的制备方法如下：在3d打印机热熔挤出喷头的加热腔内加满蔗糖粉末，设定加热温度为150℃，加热0.5h后获得可打印的焦糖墨水，随后将加热腔和喷嘴温度设置为135℃；在3d打印机软件内导入预先设定模型，打印参数设置如下：打印路径间距1.5mm，交叉角度设计为0°/90°布局；每层高度为0.45mm，设置打印层数4层，打印速率5-15mm/s，喷嘴尺寸为0.8mm。
11、进行pcl-phms支架制备时，pcl聚己内酯的分子量为50000g/mol。配置完pcl-hfip溶液后，将焦糖基模板完全浸入混合溶液中，在模板周围形成了一层薄薄的混合层，并通风将溶剂hfip蒸发，该过程中液相分离产生微孔，获得糖模复合体；然后水溶去除焦糖基模板，在真空中冷冻干燥后，制备pcl-phms支架；
12、进行pcl-明胶-phms支架时，pcl聚己内酯的分子量为50000g/mol，pcl和明胶以9:1的质量比溶解在hfip中。配置完pcl-明胶-hfip溶液后，将焦糖基模板完全浸入混合溶液中，在模板周围形成了一层薄薄的混合层，并通风将溶剂hfip蒸发，该过程中液相分离产生微孔，获得糖模复合体；然后将包被的模板放入体积比为10％:30％:60％的戊二醛-水-乙醇溶液中5min，使明胶固化；明胶固化后，将pcl-明胶糖模复合体放入蒸馏水中浸泡3h，每1h换一次水，去除焦糖基模板，在真空中冷冻干燥后，制备pcl-明胶-phms支架。
13、物理性能检测结果显示，phms支架具有良好的物质输送和液体引流功能，良好的可拉伸性、弹性和耐疲劳性，可以较好地模拟脉管和软组织的力学特性；vegf-c负载分析结果显示，支架均匀负载vegf-c细胞因子。动物模型实验结果显示，植入材料后，淋巴水肿局部淤堵淋巴液得以实现回流；局部组织切片结果显示，组织中可见围绕材料的新生组织结构，提示材料具有较好的生物相容性；淋巴管特殊荧光染色(lyve-1)染色可见局部围绕材料大量新生淋巴管；后肢组织切片显示，相较于未放置材料的淋巴水肿对照组，一期放置材料后，局部肢体未见明显肿胀，皮下脂质沉积少，皮肤纤维化程度轻。局部细胞因子检测显示，材料干预后，淋巴新生相关细胞因子(vegf-c)相较于对照组上升。
14、上述结果提示，本发明中的多通道分支化网络支架适用于淋巴水肿引流及淋巴系统再生重建。因此，本发明第二方面，提供了多通道分支化网络支架在制备淋巴水肿引流及淋巴系统再生重建器械中的应用。
15、本发明第三方面，提供了一种淋巴水肿引流及淋巴系统再生重建器械，包括上述所述的多通道分支化网络支架。
16、发明的作用与效果
17、本发明提供的适用于淋巴水肿引流及淋巴系统再生重建的多通道分支化网络支架，以3d打印的三维蔗糖模版为基体，以pcl或pcl-明胶作为修复支架材料，制备phms支架；而后在phms支架上负载促淋巴管新生因子。该支架同时具备满足如下四个要求：①具有三维多分支网络结构，可以同时实现短期快速引流以及促进长期淋巴新生的作用；②具有较好的生物相容性，减轻局部炎症反应所导致的淋巴回流异常；③可进一步负载特定生物活性成分如药物、因子等引导功能性淋巴组织的再生；④可以方便的与脂肪干细胞或其他干细胞结合形成淋巴组织工程移植物。验证实验结果也验证了上述特点，适用于作为淋巴组织工程再生修复支架材料。
1.一种多通道分支化网络支架制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的多通道分支化网络支架制备方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的多通道分支化网络支架制备方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的多通道分支化网络支架制备方法，其特征在于：
5.根据权利要求2所述的多通道分支化网络支架制备方法，其特征在于：
6.根据权利要求2所述的多通道分支化网络支架制备方法，其特征在于：
7.一种多通道分支化网络支架，其特征在于，采用权利要求1～6任一项所述的方法制备得到。
8.权利要求7所述的多通道分支化网络支架在制备淋巴水肿引流及淋巴系统再生重建器械中的应用。
9.一种淋巴水肿引流及淋巴系统再生重建器械，其特征在于，包括权利要求7所述的多通道分支化网络支架。
