本发明涉及反向遗传技术和疫苗领域，具体地说，涉及一种表达传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组新城疫病毒疫苗株及其构建方法与应用。
背景技术：
1、新城疫病毒（newcastle disease virus，ndv）与传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，ibdv）是对我国养殖产业造成重大经济损失的两个重要病原，目前接种疫苗仍是我国防控ndv、ibdv的主要手段。ibdv弱毒苗在一定水平上可以预防ibdv的发生，但弱毒苗仍有一定的致病性，会对法氏囊造成损伤，引起免疫抑制，造成其它疫苗的免疫失败；同时，母源抗体的存在也会对疫苗接种造成影响。
2、ibdv vp2蛋白已被确定为主要保护性抗原，能够刺激机体产生中和抗体，从而提高机体对病毒的抵抗能力。此外，vp2蛋白不仅在免疫原性方面起着关键作用，还在调控病毒的抗原性、毒力、抗原变异以及细胞凋亡等方面发挥着重要作用。其多重功能使得vp2蛋白成为了ibdv研究中的焦点。
3、ccl19（也被称为mip-3β/elc）是一种重要的诱导性趋化因子，当机体受到炎症刺激时，它会特异性地表达。ccl19的主要功能是通过趋化白细胞，特别是b细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞，引导它们精确地迁移到炎症部位，从而有效地发挥其趋化作用。除此之外，ccl19还具有激活树突状细胞释放细胞因子的能力，进而触发t细胞的免疫反应。细胞因子在疫苗制备过程中发挥着重要的作用，尤其对于提升疫苗的免疫原性和有效性至关重要。通过协同递送细胞因子，可以大幅度增强疫苗的效果。在针对ndv和ibdv疫苗的研究中，科研者已经探索了多种细胞因子的应用策略，以期进一步优化疫苗性能。
4、目前虽然有预防ndv和ibdv的传统疫苗，但随着变异株和超强毒株的出现，这些疾病呈现出新的特点，增加了防控的难度。因此，本发明以ndv lasota疫苗株的cdna全长为载体，以趋化因子ccl19为免疫增强剂，以ibdv的保护性抗原vp2为目标基因，通过已建立的反向遗传系统，构建表达ibdv vp2基因和趋化因子ccl19的重组嵌合型ndv，能够做到一苗双防、降低生产成本、减少免疫应激的ndv/ibdv二联苗。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种表达传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组新城疫病毒疫苗株及其构建方法与应用。
2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种表达传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组新城疫病毒疫苗株的构建方法，包括以下步骤：
3、(1)构建重组质粒：所述重组质粒包含其中插入传染性法氏囊病病毒vp2基因的新城疫lasota弱毒疫苗株的基因组cdna序列；或者，
4、所述重组质粒包含其中插入传染性法氏囊病病毒vp2基因与趋化因子ccl19基因的融合基因的新城疫lasota弱毒疫苗株的基因组cdna序列；
5、(2)将(1)的重组质粒和3个分别表达新城疫lasota弱毒疫苗株np、p、l蛋白的辅助质粒（例如，3个辅助质粒分别为pls-np、pls-p和pls-l）共转染宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；
6、(3)收获细胞裂解液或上清液，接种鸡胚尿囊腔拯救获得重组新城疫病毒疫苗株。
7、其中，vp2基因在genbank中的参考序列编号为kt884486，ccl19基因在genbank中的参考序列编号为nm_001302168；新城疫lasota弱毒疫苗株的基因组全序列在genbank中的参考序列编号为ay845400。
8、融合基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
9、进一步地，vp2基因或融合基因插入到新城疫lasota弱毒疫苗株的基因组中p基因和m基因之间。
10、优选地，宿主细胞可以是bhk-21。
11、第二方面，本发明提供按照所述方法构建得到的重组新城疫病毒疫苗株。
12、第三方面，本发明提供一种新城疫重组病毒ls-ibdv hn vp2-ccl19，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号cgmcc no.45888，保藏日期2024年4月1日。
13、第四方面，本发明提供所述重组新城疫病毒疫苗株或保藏编号为cgmcc no.45888的新城疫重组病毒在制备防控新城疫病毒和传染性法氏囊病病毒导致的疾病的疫苗中的应用。
14、第五方面，本发明提供一种新城疫病毒和传染性法氏囊病病毒二联疫苗，其有效成分为所述重组新城疫病毒疫苗株或保藏编号为cgmcc no.45888的新城疫重组病毒。
15、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
16、本发明利用已建立的ndv lasota株的反向遗传操作平台，将vp2基因或其与趋化因子ccl19的融合基因片段插入lasota株基因组全长转录载体中，得到含有传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组新城疫病毒基因组全长cdna克隆pls-ibdv-vp2经转染获得的重组病毒ls-ibdv-vp2和ls-ibdv hn vp2-ccl19。该2株重组病毒在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，连续传代仍能稳定表达vp2外源基因，能够诱导机体产生抗体，可作为同时防控新城疫病毒和传染性法氏囊病病毒的疫苗候选毒株。
1.表达传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组新城疫病毒疫苗株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，vp2基因在genbank中的参考序列编号为kt884486，ccl19基因在genbank中的参考序列编号为nm_001302168；新城疫lasota弱毒疫苗株的基因组全序列在genbank中的参考序列编号为ay845400。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，融合基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，vp2基因或融合基因插入到新城疫lasota弱毒疫苗株的基因组中p基因和m基因之间。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，宿主细胞为bhk-21。
6.按照权利要求1-5任一项所述方法构建得到的重组新城疫病毒疫苗株。
7.新城疫重组病毒ls-ibdv hn vp2-ccl19，保藏编号为cgmcc no.45888。
8.权利要求6所述重组新城疫病毒疫苗株或权利要求7所述新城疫重组病毒在制备防控新城疫病毒和传染性法氏囊病病毒导致的疾病的疫苗中的应用。
9.一种新城疫病毒和传染性法氏囊病病毒二联疫苗，其特征在于，有效成分为权利要求6所述重组新城疫病毒疫苗株或权利要求7所述新城疫重组病毒。
