本发明涉及植物原生质体制备领域，特别是涉及一种万寿菊叶片原生质体的制备方法。
背景技术：
1、万寿菊(tagetes erecta l.)为菊科万寿菊属一年生草本植物，是一种非常重要的用于工业提取叶黄素的功能花卉。叶黄素是构成视网膜黄斑区域的主要色素，能够过滤蓝光，在保护视觉、预防心血管疾病、抗癌、抗氧化等方面具有重要作用，在国际市场上供不应求，万寿菊的种植面积和产值也逐年递增。目前，通过基因工程改良万寿菊的遗传特性，提高叶黄素含量已成为分子生物学的研究热点。原生质体是去除细胞壁的植物细胞，被广泛应用于亚细胞定位、基因表达分析、蛋白-蛋白互作、基因编辑等方面，因此，获得万寿菊原生质体对后续分子生物学研究具有重要意义，然而，目前尚无万寿菊原生质体制备体系的报道。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明提供了一种万寿菊叶片原生质体的制备方法，采用本发明提供的方法能够获得大量的原生质体。
2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、本发明提供了一种万寿菊叶片原生质体的制备方法，包括以下步骤：
4、1)将万寿菊幼嫩叶片进行黑暗处理，得到处理叶片；
5、所述黑暗处理的条件包括：时间为12～48h，温度为4℃；
6、2)将所述步骤1)得到的处理叶片与原生质体酶解液混合、酶解，得到酶解物；
7、所述酶解的条件包括：在黑暗条件下酶解2～6h；
8、3)将所述步骤2)得到的酶解物过滤、离心、洗涤和纯化，得到万寿菊叶片原生质体。
9、优选的，所述步骤1)黑暗处理的时间为24h。
10、优选的，所述步骤2)酶解的时间为4h。
11、优选的，所述处理叶片与原生质体酶解液的质量比为1:10。
12、优选的，所述处理叶片处理成1～3mm宽的条状细丝后再与原生质体酶解液混合。
13、优选的，所述原生质体酶解液的组分包括：纤维素酶1.0％、离析酶0.5％、果胶酶0.4％、甘露醇0.4mol/l、2-吗啉乙磺酸0.2mol/l、cacl21.0 mol/l、kcl0.2mol/l、nah2po41.0 mol/l和牛血清蛋白0.1％，以上均为质量百分含量。
14、优选的，所述步骤2)处理叶片与原生质体酶解液混合后，真空抽提30min后再酶解。
15、优选的，所述步骤3)过滤的条件包括：使用孔径为100μm的无菌细胞筛网过滤，将得到的滤液离心，得到沉淀；
16、所述离心的条件包括：4℃、2000r/min离心5min。
17、优选的，所述步骤3)洗涤的条件包括：使用原生质体洗涤液w5洗涤，所述原生质体洗涤液w5的组分为：nacl 154mmol/l、cacl2·2h2o 125mmol/l、kcl 5mmol/l、mes2mmol/l和葡萄糖0.5％，以上百分含量为质量百分含量。
18、优选的，使用原生质体纯化液k3进行纯化，所述原生质体纯化液k3的组分为：甘露醇0.4mol/l、mgcl215 mmol/l和2-吗啉乙磺酸4mmol/l，ph5.8。
19、本发明的有益效果：
20、本发明通过对万寿菊叶片进行低温、黑暗预处理，利用原生质体酶解液、洗涤液和纯化液建立了高效的万寿菊叶片的原生质体制备体系，可在短期内获得大量完整的原生质体，为后续万寿菊原生质体培养、瞬时转化建立了坚实的基础。
1.一种万寿菊叶片原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)黑暗处理的时间为24h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)酶解的时间为4h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)处理叶片与原生质体酶解液的质量比比为1:10。
5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，所述处理叶片处理成1～3mm宽的条状细丝后再与原生质体酶解液混合。
6.根据权利要求1、4或5所述的制备方法，其特征在于，所述原生质体酶解液的组分包括：纤维素酶1.0％、离析酶0.5％、果胶酶0.4％、甘露醇0.4mol/l、2-吗啉乙磺酸0.2mol/l、cacl21.0 mol/l、kcl 0.2mol/l、nah2po41.0 mol/l和牛血清蛋白0.1％，以上均为质量百分含量。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)处理叶片与原生质体酶解液混合后，真空抽提30min后再酶解。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)过滤的条件包括：使用孔径为100μm的无菌细胞筛网过滤，将得到的滤液离心，得到沉淀；
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)洗涤的条件包括：使用原生质体洗涤液w5洗涤，所述原生质体洗涤液w5的组分为：nacl 154mmol/l、cacl2·2h2o125mmol/l、kcl 5mmol/l、mes2mmol/l和葡萄糖0.5％，以上百分含量为质量百分含量。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，使用原生质体纯化液k3进行纯化，所述原生质体纯化液k3的组分为：甘露醇0.4mol/l、mgcl215mmol/l和2-吗啉乙磺酸4mmol/l，ph5.8。
