本发明涉及分析检测，特别是涉及一种用于检测亚硫酸氢根离子的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术：
1、亚硫酸根作为大自然环境中的主要污染源之一，作为体内亚硫酸盐水平异常与多种疾病有关。亚硫酸盐的摄入量有严格的规定。因此，为了监测生理病理事件中的亚硫酸盐水平，迫切需要开发一种快速、准确、敏感、无创的方法，这对提高相应的临床诊断也具有重要意义。
2、在这种情况下，许多分析技术已经在过去几十年中开发的用于亚硫酸根。亚硫酸根的常规方法检测包括电化学分析，色谱，流动注射分析，化学发光分析，毛细管电泳和光谱学分析。这些方法通常需要复杂的程序和昂贵的仪器，并且不能准确评估生物系统中亚硫酸盐的波动。其中，荧光和磷光光谱分析因其灵敏度高、特异度高、简便、响应快、效率高等特点近年来引起了广泛的关注。亚硫酸根本身是非荧光的，亚硫酸根响应荧光探针是检测这些物种的关键工具。利用响应探针，亚硫酸根探针导致亚硫酸根可记录的发射信号的变化。检测到目前为止，已经报道了数百种响应探针，包括分子探针和纳米探针，用于亚硫酸根，而这些探针大多用于分析亚硫酸根生物系统中的水平。
3、近年来，越来越多高效且应用背景良好的有机荧光材料受到了广泛关注。然而，随着深入研究，传统有机荧光材料的特点，如生物相容性差和高细胞毒性逐渐受到关注。因此，近期研究者开始关注设计和合成新型环保低毒的有机荧光材料。异长叶烷酮是一种来源于松节油的重要萜烯类化合物，具有低细胞毒性、高反应活性、良好生物相容性、优良细胞渗透性和环保无污染等特点，是合成新型有机荧光材料的理想选择。王教授课题组在利用异长叶烷酮为骨架的研究中的探索引起了越来越多人的关注。他们发现，异长叶烷酮衍生物探针不仅可以有效弥补传统有机小分子探针的缺陷(例如高毒性、溶解性差、细胞穿透性差等)，而且具有良好的细胞穿透性，可用于对活细胞进行检测和成像，从而拓展了异长叶烷酮在生物领域的应用潜力。
4、再比如公开号为cn109761917a的专利申请公开的异长叶烷酮基-2-氨基嘧啶类三氟化硼荧光探针及其合成方法与应用，其能选择性的与三氟化硼反应，在365nm紫外光照射下产生明显的荧光变化；再如公开号为cn106632084a的专利申请公开的异长叶烷酮基六氢喹唑啉-2-胺席夫碱类锌离子荧光探针，制备的化合物仅能与锌离子形成络合物，该络合物在365nm紫外光照射下发出绿色荧光，可作为锌离子浓度检测用荧光探针。
5、但对于在检测亚硫酸根离子方面还未见报道。
技术实现思路
1、为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的是提供一种荧光探针。该探针具有分子内电荷转移效应，以乙酰丙酸酯为识别基团，实现对亚硫酸根离子的检测。
2、本发明的再一目的在于提供上述荧光探针在亚硫酸根离子检测中的应用。
3、本发明目的通过以下技术方案实现：
4、一种用于检测亚硫酸氢根离子的荧光探针，其结构式如式i：
5、
6、本发明还提供了所述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
7、(1)香草醛在强碱下进行去质子化反应，之后与溴甲基甲基醚发生取代反应得到反应物原料；
8、(2)将异长叶烷酮与步骤(1)得到的反应物原料在碱性条件下反应制得产物1；
9、(3)将产物1和3-氨基吡唑在碱性条件下反应制得产物2；
10、(4)将产物2与盐酸反应得到产物3；
11、(5)将产物3和乙酰丙酸反应得到最终产物ifa-1，即所述异长叶烷酮基荧光探针。
12、在本发明的一些实施技术方案中，步骤(1)中，香草醛在冰浴条件下加入强碱进行去质子化反应，反应后，加入溴甲基甲基醚，撤去冰浴，常温反应3h；
13、所述强碱为氢化钠，
14、所述香草醛、强碱和溴甲基甲基醚的摩尔比例为1∶1.2-3∶1.2-3。
15、在本发明实施例中，选择香草醛、强碱和溴甲基甲基醚的摩尔比例为1∶1.2∶1.2作为示例。
16、在本发明的一些实施技术方案中，步骤(2)中，所述碱性条件使用的碱为氢氧化钾，
17、所述反应的条件为：在85-90℃下回流反应4-8h，得到产物1，
18、所述产物1、异长叶烷酮和叔丁醇钾的摩尔比例为1∶1.2-3∶1.5-3。
19、在本发明实施例中，选择产物1、异长叶烷酮和叔丁醇钾的摩尔比例为1∶1.2∶1.5作为示例。
20、在本发明的一些实施技术方案中，步骤(3)中，所述碱性条件使用的碱为叔丁醇钾，
21、所述反应的条件为：在85-90℃下回流反应20-30h，得到产物2，
22、所述产物2、3-氨基吡唑和叔丁醇钾的摩尔比例为1∶1.5-3∶1.5-3。
23、在本发明实施例中，选择产物2、3-氨基吡唑和叔丁醇钾的摩尔比例为1∶1.5∶1.5作为示例。
24、在本发明的一些实施技术方案中，步骤(4)中，所述盐酸的浓度为1mol/l，
25、所述反应的条件为：在62-65℃下回流反应2-6h，得到产物3。
26、在本发明的一些实施技术方案中，步骤(5)中，在偶联试剂和催化剂存在的条件下，产物3和乙酰丙酸反应24h得到最终产物ifa-1；
27、所述偶联试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，
28、所述催化剂为对二甲氨基吡啶，
29、所述产物3、偶联试剂、催化剂和乙酰丙酸的摩尔比例为1∶1.2-3∶0.5-3∶1.5-3，得到最终产物ifa-1。
30、在本发明实施例中，选择产物3、偶联试剂、催化剂和乙酰丙酸的摩尔比例为1∶1.2∶0.5∶1.5作为示例。
31、本发明实施例中，作为示例的，选择的摩尔比例是最佳条件比例，在其他比例下，也同样具有效果，即得到的最终化合物(荧光探针)均可用于特异性检测亚硫酸根离子。
32、具体步骤为：
33、1)将香草醛溶于四氢呋喃中，在冰浴条件下加入分配加入1.2倍摩尔当量的氢化钠，反应几个小时后，缓慢加入1.2倍摩尔当量的溴甲基甲基咪，撤去冰浴，常温反应3小时得到反应物原料；
34、2)将步骤(1)的反应物溶解于乙醇中，加入1.5倍摩尔当量叔丁醇钾和1.2倍摩尔当量异长叶烷酮，回流反应6小时，分离纯化得到产物1；
35、3)将步骤(2)的产物1溶解于乙醇中，加入1.5倍摩尔当量叔丁醇钾和1.5倍摩尔当量3-氨基吡唑，回流反应30小时后，分离纯化得到产物2；
36、4)将步骤(3)的产物2溶解于甲醇中，加入适量盐酸回流反应3小时后，分离纯化得到产物3；
37、将步骤(4)产物3溶解于二氯甲烷中，加入1.2倍摩尔当量1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和0.5倍摩尔当量对二甲氨基吡啶后，加入1.5倍摩尔当量乙酰丙酸，在室温条件下反应18小时后的得到粗品，所述的分离纯化步骤为：反应结束后，用水与二氯甲烷萃取，取有机相，干燥，过滤；旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析纯化最终产物ifa-1。
38、本发明所得产物荧光探针化合物为分子式为c31h39n3o4，相对分子质量为515.27。为白色固体粉末，不溶于水，易溶于二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基亚砜等有机溶剂。该化物光稳定性好，化学稳定性好，无毒。
39、在中性条件下，亚硫酸根离子会与荧光探针中的乙酰丙酸酯的羰基发生亲核加成反应。进一步地，所生成的羟基会发生分子内的环化反应，最后脱去，从而生成荧光化合物ifa-oh，响应后的荧光化合物ifa-oh由于分子内电荷转移，使荧光基团上的电子能量增加，在304nm的激发光照射下，荧光在485nm处的荧光强度随着亚硫酸根的浓度增强。因此，本发明荧光探针可用于特异性检测亚硫酸根离子。
40、本发明还提供了所述的荧光探针在检测亚硫酸根离子中的应用。
41、本发明还提供了所述的荧光探针在制备检测亚硫酸根离子的试剂盒中的应用。
42、相对于现有技术，本发明提供的探针的突出优点包括：
43、(1)本发明的探针利用乙酰丙酸酯为识别基团，其能够特异性地与亚硫酸根离子发生亲核加成反应，因此本探针可准确高效地识别亚硫酸根离子。
44、(2)本发明探针合成简单，制备容易，检测灵敏度高。
45、(3)本发明的探针具有低毒性好良好的生物相容性。
46、(4)本发明的荧光探针能够实现对亚硫酸根离子的灵敏检测，可在食品和环境中亚硫酸根离子检测的应用。
1.一种用于检测亚硫酸氢根离子的荧光探针，其特征在于，结构式如式i：
2.权利要求1所述荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，香草醛在冰浴条件下加入强碱进行去质子化反应，反应后，加入溴甲基甲基醚，撤去冰浴，常温反应3h；
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述碱性条件使用的碱为氢氧化钾，
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述碱性条件使用的碱为叔丁醇钾，
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述盐酸的浓度为1mol/l，
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，在偶联试剂和催化剂存在的条件下，产物3和乙酰丙酸反应22-24h得到最终产物ifa-1；
8.权利要求1所述的荧光探针在检测亚硫酸根离子中的应用。
9.权利要求1所述的荧光探针在制备检测亚硫酸根离子的试剂盒中的应用。
