本申请涉及生物医药领域，具体地，涉及一种猪链球菌保护性抗原蛋白检测和该蛋白用于制作猪链球菌不同血清型交叉保护性抗原疫苗的应用及其制备方法。
背景技术：
1、猪链球菌是一种重要的人兽共患病原菌，可经呼吸道、伤口等感染，猪发病后表现出脑膜炎、心肌炎、关节炎及败血症等症状。近年来，国内猪链球菌2、7、9型均具有较高的流行性，对生猪养殖业造成了严重的危害。
2、目前，我国对于猪链球菌病的预防和治疗仍以抗生素为主，但近年来滥用抗生素的现象十分严重，从而导致耐药菌株不断出现，疫病得不到有效防治，造成大面积扩散，严重危害人兽健康。控制猪链球菌病上，疫苗对动物疫病的预防发挥着重要作用，选择安全、可靠的疫苗对动物进行接种，能够使动物产生高的抗体水平抵抗细菌的感染。
3、张安定、李书光等开展的猪链球菌保护性抗原筛选和验证工作证实了反向疫苗学技术在开展疫苗研发方面的可行性，而且也为开发猪链球菌2、7、9型通用疫苗提供了参考。鉴于猪链球菌血清型较多，而目前缺乏针对不同血清型猪链球菌病原提供交叉保护的通用疫苗，因此开展猪链球菌多血清型通用疫苗候选抗原的研究工作对该病的科学防控具有重要的意义。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种猪链球菌免疫原性抗原蛋白在制备猪链球菌检测试剂盒或猪链球菌不同血清型交叉保护性抗原疫苗方面的应用。旨在为制作预防猪链球菌的不同血清型交叉保护性抗原疫苗提供便利，为感染猪链球菌所引发疾病的防控提供帮助。在本发明的一个实施例中，所述猪链球菌选自血清型2、7、9型的一种或多种。在本发明的另一个实施例中，本发明所述的蛋白可用于提升细胞因子il-17a、i fn-γ及i l-10中一种或多种的表达水平，从而刺激细胞产生抗体，为用于制备猪链球菌检测试剂盒或猪链球菌不同血清型交叉保护性抗原疫苗方面的应用提供了基础。
2、本发明首先根据protein数据库对猪链球菌蛋白的描述，在ncbi数据库中下载蛋白序列，通过tmhmm筛选蛋白的跨膜情况，vaxign预测蛋白疫苗特性，保留黏附参数在0.5以上的蛋白；随后进行信号肽预测，删除可能的信号肽序列，通过blast进行不同血清型的蛋白比对，保留常见致病性血清型共有或者部分共有的蛋白质序列，本发明所述的蛋白序列即为上述方法筛选到的其中一种，该蛋白名称已经被ncbi注释，为细胞壁结合域(lpxtgcell wall anchor domain-containing protein)，ncbi登录号为wp_014736444.1，申请人将该蛋白的编码基因命名为5493基因，相应的，其表达蛋白命名为5493蛋白。蛋白质的氨基酸序列如seq id no：3所示。
3、本发明第二个方面，提供了一种猪链球菌检测试剂盒以及一种猪链球菌不同血清型交叉保护性抗原疫苗，所述试剂盒和亚单位疫苗中分别含有所述的蛋白质。优选地，所述试剂盒为间接elisa试剂盒或全血杀菌试剂盒，更优选地，所述间接elisa试剂盒可用于检测选自猪链球菌血清型2型、7型和9型中的一种或多种的检测，所述全血杀菌试剂盒可用于灭杀选择血清型为2型、7型和9型中的一种或多种猪链球菌。
4、本发明第三个方面，提供了该蛋白的制备方法，所述蛋白质的制备方法如下：
5、1)以5493蛋白的基因组dna为模板，设计pcr引物扩增编码所述蛋白质的目的基因；优选地，所述pcr引物(5’-3’端)为：上游：gatatcggatccgagaattatccgtcacttgca(seqid no：4)；下游ggccgcaagcttgttttttgacaagacaggcgctcaag(seq id no：5)。
6、2)将1)获得的扩增产物克隆至pet30载体，获得包含所述目的基因的重组表达质粒；
7、3)将2)获得的重组表达质粒转化至感受态细胞进行诱导表达，获得包含所述蛋白质的宿主菌；
8、4)从3)获得的宿主菌中分离纯化所述蛋白质。
9、本发明的第四个方面，提供了优化后的编码该蛋白的多核苷酸序列。核苷酸序列如seq id no：2所示。
10、本发明的第五个方面，提供了一种生物材料，所述生物材料如1)-3)任一种：
11、1)包含权利要求9所述的多核苷酸序列，以及与之可操作连接、可指导蛋白序列在表达宿主中生产的一个或多个控制序列。
12、2)包含1)所述的核酸构建体的表达载体。
13、3)包含转化了1)所述的核酸构建体或2)所述的表达载体的转化细胞。
14、本申请的有益效果包括但不限于：
15、1.根据本申请的猪链球菌病保护性抗原，将抗原蛋白与铝胶佐剂混合免疫新西兰白兔，在二次加强免疫以后抗体水平就呈现明显的升高趋势，表明该抗原蛋白可诱导机体产生良好的体液免疫效果。
16、2.根据本申请的猪链球菌病保护性抗原，全血杀菌作用对猪链球菌2、7、9型型明显，与新西兰白兔的攻毒保护效果结果一致。
17、3.根据本申请的猪链球菌病保护性抗原，该抗原蛋白的刺激对细胞因子il-17a、ifn-γ及i l-10的作用明显，表明该蛋白可刺激机体产生应对猪链球菌感染的免疫反应。
18、4.根据本申请的猪链球菌病保护性抗原，在对蛋白的交叉保护评价试验中5493组兔的发病及死亡情况均减少，对猪链球菌2型、7型、9型的保护率分别为50％、50％、80％。
1.氨基酸序列如seq id no：3所示的蛋白质在调节细胞因子il-17a、ifn-γ及il-10中一种或多种表达水平的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调节细胞因子il-17a、ifn-γ及il-10中一种或多种表达水平的用途为提升细胞因子il-17a、ifn-γ及il-10中一种或多种的表达水平。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质在制备猪链球菌检测试剂盒或猪链球菌不同血清型交叉保护性抗原疫苗方面的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述猪链球菌选自血清型为2型、7型或9型猪链球菌中的一种或多种。
5.一种猪链球菌检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1中所述的蛋白质。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是检测猪链球菌间接elisa试剂盒或全血杀菌试剂盒。
7.一种猪链球菌不同血清型交叉保护性抗原疫苗疫苗，其特征在于：所述疫苗中含有权利要求1中所述的蛋白质。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质的制备方法包括以下步骤：
9.编码权利要求1所述蛋白质的多核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列如seq idno：2所示。
10.生物材料，其特征在于，所述生物材料如1)-3)任一种：
