本发明涉及一种用于检测或诊断基孔肯雅病毒的单克隆抗体，其相关应用，以及相关产品(如试剂盒等)，属于生物医药。
背景技术：
1、基孔肯雅病毒(chikungunya virus，chikv)属于披膜病毒科甲病毒的成员，主要通过白蚊伊蚊或埃及伊蚊的叮咬感染人类，少数可通过母婴传播[1]或血液制品[2]传播，感染引发基孔肯雅热(chikungunya fever，chikf)。感染者临床表现主要为突发高热、多关节痛及皮疹[3]，部分患者的关节炎可持续数月至数年[4]，最终引起关节畸形[5,6]。高龄、幼童以及有基础疾病的患者可发生严重并发症，如神经系统疾病(包括格林-巴利综合征、脑炎、癫痫)、呼吸衰竭、心肌炎、心力衰竭、急性肝炎、急性肾衰竭、横纹肌溶解、大疱性皮肤病、感染性休克[7-15]等。cerbino-neto等[16]在一项回顾性研究中表明，chikf的病死率在0.1％至33％不等，但重症患者的病死率高达48％。
2、1952年chikf首次暴发于坦桑尼亚，在随后的数十年间，chikv在亚洲、欧洲、美洲等多地爆发。2005年大科摩罗岛21.5万人感染[17]，同年留尼汪岛26.6万人感染[18]，截止2006年，印度chikv感染人数高达130万[19]。自2013年美洲发现首例本土基孔肯雅热患者以来[20]，chikv开始在美洲大陆肆虐，截至2016年，chikv传播至南美洲和北美洲约45个地区或国家，共计造成了约290万人感染[21]。随着全球气候变暖、经济贸易往来日益密切及国际间旅行业的迅猛发展，基孔肯雅热在全球范围内的传播扩散愈发严重，目前全球每年约有100万病例，死亡率可达0.1％[22]。因此，对基孔肯雅热的有效防控已然势在必行，也是当前全球防疫工作中面临的巨大挑战。
3、自1987年我国云南地区首次检测出基孔肯雅病毒以来[23]，广州、深圳、北京、天津、杭州、衢州、遵义、河南等多地相继出现了chikv输入性病例[24]。此外，2010年东莞出现社区基孔肯雅热疫情[25]，确诊病例达280例；2019年云南地区发生本地基孔肯雅热疫情，确诊病例112例[26]。随着近年来国内输入病例的不断增加，加上气候变暖导致的流行范围有从南向北逐步扩展的趋势，基孔肯雅热很有可能成为下一个大规模爆发的蚊媒病毒性传染性疾病。况且，国民对基孔肯雅病毒普遍易感，人群又缺乏免疫屏障，其危险程度极高。因此，提早做好对该病毒的防范技术储备为我国应对基孔肯雅病毒的传入至关重要。
4、当前，针对chikv的疫苗尚处研发阶段，主要包括载体疫苗、减毒活疫苗、病毒样颗粒疫苗和dna疫苗[27]。其中，以基孔肯雅病毒e1、e3和衣壳蛋白组成的病毒样颗粒疫苗已于2013年完成了ⅰ期临床试验[28]，并于2018年完成了ⅱ期临床试验[29]；另一种以麻疹为载体的基孔肯雅病毒疫苗也于2017年完成了ⅱ期临床试验[30]；但尚无真正上市的疫苗。临床上也无针对chikv的特异性抗病毒药物，治疗上只能采用非甾体类抗炎药(nsaids)控制发热和急性疼痛症状[31]，以及补液、休息等对症支持治疗。然而，非甾体类抗炎药应用于登革热患者可引发出血[32]，是登革热患者的禁忌药。而同以白蚊伊蚊和埃及伊蚊为传播媒介的denv与chikv经常在同一疫区交叉流行，其临床表现及其相似，很难通过临床症状加以鉴别。因此，开发出登革病毒和基孔肯雅病毒鉴别诊断工具对于基孔肯雅热的诊治十分必要。
5、目前针对chikv的实验室检测方法主要包括病毒分离、分子生物学和血清学检测方法[33]。其中病毒分离是确诊chikv的金标准，临床上多采用c6/36或vero细胞进行分离培养，chikv感染早期的急性发热阶段对应于病毒血症期，通常持续5天，可从患者血清、血浆、全血或尸检组织中分离获得病毒[34]。但其操作技术及实验条件要求苛刻(需要在bsl-3实验室操作)，操作人员专业化要求高，且培养耗时长，不适合于chikf大规模爆发疫情的筛查诊断。而分子生物学检测技术更适用于感染2-6天的患者的诊断，具有较高的特异性和灵敏性，可用于chikv感染的早期诊断。但分子诊断实施检测需特殊设备及专业技术人员，且存在较高的污染风险，对于大规模疫情筛查存在诸多不便。血清学检测方法目前在chikv诊断方面应用较为广泛，如yang等以重组e2抗原开发的chikv igg免疫印迹法[33]，欧蒙的间接免疫荧光试剂盒，galo等开发的igm捕获elisa法[35]。这些均为基于抗体检测的方法，而大量临床数据显示，抗体检测对于病毒感染1周内的患者敏感性较低[33,36]，5-7天后检出率才显著上升，达不到早期诊断的目的[37]。显然，抗原检测具有更合适的时间窗和更高的早期诊断灵敏度[38]，相较于rt-pcr，操作安全便捷，更适合用于大规模疫情的筛查，但目前国内外尚无有针对chikv的商业化抗原检测试剂盒。
技术实现思路
1、本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供用于检测或诊断基孔肯雅病毒的单克隆抗体，能特异性结合基孔肯雅病毒e1蛋白；同时还提供其相关应用、以及相关产品，例如免疫检测或诊断试剂盒，灵敏度高，特异性强，能快速、准确地检测出基孔肯雅病毒。
2、本发明的研究过程为：建立抗原检测方法首要的目标是选择合适的抗原靶标。本发明的发明人研究团队调研了近年来国内外关于基孔肯雅病毒的抗原检测方法的文献[39-41]，使用过的抗原主要包括e1蛋白、e2蛋白和基孔肯雅病毒样颗粒。其中，e1蛋白的序列相对保守，不易突变，且在高病毒血症的急性感染期，e1会以高浓度分泌到人血中[42]，因此，发明人研究团队以e1蛋白作为靶标抗原，制备其特异性的单克隆抗体，以期能够建立敏感和特异的抗原检测方法。
3、作为上述研究的成果，本发明的技术方案如下：
4、一种用于检测或诊断基孔肯雅病毒的单克隆抗体ch-m11，其特征是，所述单克隆抗体ch-m11包括重链和轻链，所述重链包括：重链cdr1，其氨基酸序列为gftfsdyy；重链cdr2，其氨基酸序列为isdggtfi；重链cdr3，其氨基酸序列为vrggghrdeavysmdy；所述轻链包括：轻链cdr1，其氨基酸序列为qsigts；轻链cdr2，其氨基酸序列为yas；轻链cdr3，其氨基酸序列为qqsnswpft。
5、优选地，所述单克隆抗体ch-m11的重链还包括：重链fr1，其氨基酸序列为：evqlvesggglvdpggslktscaas；重链fr2，其氨基酸序列为：mtwvrqwphkylewvat；重链fr3，其氨基酸序列为：yycdsvkgrfpisrdnaknglylqmsslksedtamyyc；重链fr4，其氨基酸序列为：wgqgtlvtvss；
6、或者，所述单克隆抗体ch-m11的轻链还包括：轻链fr1，其氨基酸序列为：dilltqspadlsvspgervsfscras；轻链fr2，其氨基酸序列为：ihwyqqrtagsprllik；轻链fr3，其氨基酸序列为：esisgipsrfsgsgsgtdftlyinsvesediadyyc；轻链fr4，其氨基酸序列为：fgsgtrleir；
7、或者，所述单克隆抗体ch-m11的重链可变区序列与seq id no.1具有90％-100％的序列同一性；
8、或者，所述单克隆抗体ch-m11的轻链可变区序列与seq id no.2具有90％-100％的序列同一性。
9、一种用于检测或诊断基孔肯雅病毒的单克隆抗体ch-m6，其特征是，所述单克隆抗体ch-m6包括重链和轻链，所述重链包括：重链cdr1，其氨基酸序列为：gftfssya；重链cdr2，其氨基酸序列为：isngggyt；重链cdr3，其氨基酸序列为：arrfittvvenamdy；所述轻链包括：轻链cdr1，其氨基酸序列为：qsvlyssdqkny；轻链cdr2，其氨基酸序列为：was；以及轻链cdr3，其氨基酸序列为：hqylssyt。
10、优选地，所述单克隆抗体ch-m6的重链还包括：重链fr1，其氨基酸序列为：evqlvesggglvkpggslklscaas；重链fr2，其氨基酸序列为：mswvrqgpedslewvat；重链fr3，其氨基酸序列为：yysdsvkgrfti srdnaentlylqmaslrsedtacyyc；重链fr4，其氨基酸序列为：wgq gtmvtvss；
11、或者，所述单克隆抗体ch-m6的轻链还包括：轻链fr1，其氨基酸序列为：nicmtqspsslavsagekvthrcrss；轻链fr2，其氨基酸序列为：lawyqqkpgqspkllir；轻链fr3，其氨基酸序列为：sresgvpdrftgsg sgtdfslmihsvqaedtavyyc；轻链fr4，其氨基酸序列为：fgggtkle mk；
12、或者，所述单克隆抗体ch-m6的重链可变区序列与seq id no.3具有90％-100％的序列同一性；
13、或者，所述单克隆抗体ch-m6的轻链可变区序列与seq id no.4具有90％-100％的序列同一性。
14、本发明还提供：
15、一种用于检测或诊断基孔肯雅病毒的单克隆抗体，其特征是，所述单克隆抗体为前文所述的单克隆抗体ch-m11和/或前文所述的单克隆抗体ch-m6。
16、编码前文所述单克隆抗体的核酸分子。
17、含有前文所述核酸分子的杂交瘤细胞。
18、前文所述单克隆抗体或前文所述核酸分子用于非诊断目的检测基孔肯雅病毒、制备检测基孔肯雅病毒的检测产品、制备诊断基孔肯雅病毒相关疾病的诊断产品、制备抑制基孔肯雅病毒感染的药物、或制备治疗基孔肯雅病毒相关疾病的药物的应用。
19、一种针对基孔肯雅病毒的检测或诊断产品，其特征是，采用前文所述的单克隆抗体ch-m11为捕获抗体，并采用前文所述的单克隆抗体ch-m6为检测抗体。
20、优选地，所述检测或诊断产品为采用双抗体夹心elisa法或胶体金法或荧光标记法的免疫检测或诊断试剂盒；
21、所述免疫检测或诊断试剂盒还包括：包被捕获抗体的微孔反应板，样品处理液，标记有标记物的检测抗体的工作液，浓缩洗涤液，阳性对照液，阴性对照液，显色液，以及终止液；
22、所述标记物选自生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金、荧光素，纳米酶；当标记物为生物素时，所述免疫检测或诊断试剂盒还包括：标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的亲和素。
23、其中，亲和素能与生物素以1:4的比例结合，起到放大检测信号的作用，能进一步提高检测的灵敏度。
24、本发明经筛选获得的单克隆抗体ch-m11、ch-m6能特异性结合基孔肯雅病毒e1蛋白的不同位点，而与其它病毒(如登革病毒、黄热病毒、乙型脑炎病毒)均无交叉反应；采用单克隆抗体ch-m11、ch-m6构建的免疫检测或诊断试剂盒能准确、快速地检测出基孔肯雅病毒，检测灵敏度可达122pg/ml，检测基孔肯雅病毒培养上清的最高稀释度为1:10240，灵敏度高，特异性强，具有良好的应用前景。
1.一种用于检测或诊断基孔肯雅病毒的单克隆抗体ch-m11，其特征是，所述单克隆抗体ch-m11包括重链和轻链，所述重链包括：重链cdr1，其氨基酸序列为gftfsdyy；重链cdr2，其氨基酸序列为isdggtfi；重链cdr3，其氨基酸序列为vrggghrdeavysmdy；所述轻链包括：轻链cdr1，其氨基酸序列为qsigts；轻链cdr2，其氨基酸序列为yas；轻链cdr3，其氨基酸序列为qqsnswpft。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测或诊断基孔肯雅病毒的单克隆抗体ch-m11，其特征是，所述单克隆抗体ch-m11的重链还包括：重链fr1，其氨基酸序列为：evqlvesggglvdpggslktscaas；重链fr2，其氨基酸序列为：mtwvrqwphkylewvat；重链fr3，其氨基酸序列为：yycdsvkgrfpisrdnaknglylqmsslksedtamyyc；重链fr4，其氨基酸序列为：wgqgtlvtvss；
3.一种用于检测或诊断基孔肯雅病毒的单克隆抗体ch-m6，其特征是，所述单克隆抗体ch-m6包括重链和轻链，所述重链包括：重链cdr1，其氨基酸序列为：gftfssya；重链cdr2，其氨基酸序列为：isngggyt；重链cdr3，其氨基酸序列为：arrfittvvenamdy；所述轻链包括：轻链cdr1，其氨基酸序列为：qsvlyssdqkny；轻链cdr2，其氨基酸序列为：was；以及轻链cdr3，其氨基酸序列为：hqylssyt。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测或诊断基孔肯雅病毒的单克隆抗体ch-m6，其特征是，所述单克隆抗体ch-m6的重链还包括：重链fr1，其氨基酸序列为：evqlvesggglvkpggslklscaas；重链fr2，其氨基酸序列为：mswvrqgpedslewvat；重链fr3，其氨基酸序列为：yysd svkgrftisrdnaentlylqmaslrsedtacyyc；重链fr4，其氨基酸序列为：wgqgtmvtvss；
5.一种用于检测或诊断基孔肯雅病毒的单克隆抗体，其特征是，所述单克隆抗体为权利要求1或2所述的单克隆抗体ch-m11和/或权利要求3或4所述的单克隆抗体ch-m6。
6.编码权利要求5所述单克隆抗体的核酸分子。
7.含有权利要求6所述核酸分子的杂交瘤细胞。
8.权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述核酸分子用于非诊断目的检测基孔肯雅病毒、制备检测基孔肯雅病毒的检测产品、制备诊断基孔肯雅病毒相关疾病的诊断产品、制备抑制基孔肯雅病毒感染的药物、或制备治疗基孔肯雅病毒相关疾病的药物的应用。
9.一种针对基孔肯雅病毒的检测或诊断产品，其特征是，采用权利要求1或2所述的单克隆抗体ch-m11为捕获抗体，并采用权利要求3或4所述的单克隆抗体ch-m6为检测抗体。
10.根据权利要求9所述的一种针对基孔肯雅病毒的检测或诊断产品，其特征是，所述检测或诊断产品为采用双抗体夹心elisa法或胶体金法或荧光标记法的免疫检测或诊断试剂盒；
