发明领域本发明涉及使用感染因子检测微生物的组合物、方法、系统和试剂盒。
背景技术：
0、背景
1、人们对提高检测生物、食品、水和临床样品中细菌、病毒和其他微生物的速度和灵敏度非常感兴趣。微生物病原体可导致人和家畜的大量死亡，以及巨大的经济损失。此外，鉴于因摄入被某些微生物(例如克罗诺杆菌属种(cronobacter spp.)、沙门氏菌属种(salmonella spp.)、李斯特菌属种(listeria spp.)或葡萄球菌属种(staphylococcusspp.))污染的食物而导致的威胁生命或致命疾病的爆发，检测微生物是食品与药物管理局(fda)、疾病控制中心(cdc)以及美国农业部(usda)关注的高度优先级事项。
2、用于检测细菌的常规微生物检验依赖于非选择性和选择性富集培养，随后在选择性培养基上进行铺板，并进一步检验以确认可疑菌落。此类程序可能需要几天时间。已经研究了多种快速方法并将其引入实践中以减少时间需求。然而，这些方法有缺点。例如，涉及直接免疫测定或基因探针的技术通常需要过夜富集步骤以获得足够的灵敏度。聚合酶链式反应(pcr)测试也包括扩增步骤，因此能够具有非常高的灵敏度和选择性；然而，能够经济地进行pcr检验的样品量是有限的。对于稀的细菌悬浮液，大多数小的子样品将不含细胞，因此仍然需要纯化和/或长时间的富集步骤。
3、常规生物富集所需的时间由样品中目标细菌群体的生长率、样品基质的作用和所需的灵敏度决定。实际上，大多数高灵敏度方法采用过夜孵育，总共需要约24小时。由于培养需要时间，因此这些方法可能花费三天时间，这取决于待鉴定的生物体和样品的来源。这种滞后时间通常是不合适的，因为受污染的食物、水或其他产品可能已经进入牲畜或人体内。另外，抗生素抗性细菌和生物防御因素的增加使得快速鉴定水、食品和临床样品中的细菌病原体成为全球的关键优先级事项。
4、因此，需要更快速、简单和灵敏地检测和鉴定微生物，诸如细菌和其他潜在的病原性微生物。
技术实现思路
1、本发明的实施方案包括用于检测微生物诸如克罗诺杆菌属种的组合物、方法、系统和试剂盒。本发明可以以多种方式实施。
2、在一些方面，本发明包括重组噬菌体，其包含插入噬菌体基因组的晚期基因区中的指示基因。在一些实施方案中，重组噬菌体是经遗传修饰的克罗诺杆菌属特异性噬菌体基因组。在某些实施方案中，重组噬菌体包含经遗传修饰的噬菌体基因组，该基因组来源于特异性识别克罗诺杆菌属种(以前被分类为阪崎肠杆菌(enterobacter sakazakii))的噬菌体。在一些实施方案中，用于制备重组噬菌体的噬菌体特异性感染一种或多种克罗诺杆菌。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在其他类型的细菌存在的情况下区分出克罗诺杆菌属种。
3、在重组指示噬菌体的一些实施方案中，指示基因可以是密码子优化的，并且可以编码产生内在信号的可溶性蛋白质产物或在与底物反应时产生信号的可溶性酶。一些重组噬菌体还包含密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其中所述非翻译区包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。在一些实施方案中，指示基因是萤光素酶基因。萤光素酶基因可以是天然存在的基因，诸如刺虾(oplophorus)萤光素酶、萤火虫萤光素酶、lucia萤光素酶或海肾萤光素酶，或者其可以是经遗传工程改造的基因，诸如
4、本文还公开了制备重组指示噬菌体的方法。一些实施方案包括选择特异性感染目标致病菌的野生型噬菌体；制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；将同源重组质粒/载体转化到目标致病菌中；用选择的野生型噬菌体感染转化的目标致病菌，从而允许质粒/载体和噬菌体基因组之间发生同源重组；以及分离重组噬菌体的特定克隆。在一些实施方案中，所选的野生型噬菌体是克罗诺杆菌属特异性噬菌体。在一些实施方案中，所选的野生型噬菌体是肌病毒，诸如t4病毒、t4样病毒或vil样病毒。在一些实施方案中，所选的野生型噬菌体感染克罗诺杆菌属种，诸如噬菌体saka2或saka4。克罗诺杆菌属种噬菌体saka2和saka4是新分离和测序的噬菌体，可能是肌病毒。在其他实施方案中，所选野生型噬菌体是短尾病毒，诸如t7样病毒或sp6样病毒。在其他实施方案中，所选的野生型噬菌体是saka10。saka10是新分离和测序的噬菌体，可能是与t7噬菌体相关的短尾病毒。
5、在一些实施方案中，制备同源重组质粒/载体包括确定所选噬菌体基因组的晚期区域的天然核苷酸序列；注释基因组并鉴定所选噬菌体的主要衣壳蛋白基因；设计主要衣壳蛋白基因下游的用于同源重组的序列，其中该序列包含密码子优化的指示基因；以及将设计用于同源重组的序列整合到质粒/载体中。设计序列的步骤可包括在密码子优化的指示基因的上游插入包含非翻译区的遗传构建体，所述非翻译区包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。在一些实施方案中，所述噬菌体晚期基因启动子是外源启动子，不同于噬菌体基因组中的任何内源启动子。因此，在一些方法中，所述同源重组质粒包含非翻译区，该非翻译区包括噬菌体晚期基因启动子和密码子优化的指示基因上游的核糖体进入位点。
6、本发明的一些实施方案是包含如本文所述的重组指示噬菌体的组合物。例如，组合物可包括一种或多种野生型或经遗传修饰的感染因子(例如，噬菌体)和一种或多种指示基因。在一些实施方案中，组合物可包括不同指示噬菌体的混合物，所述指示噬菌体可编码和表达相同或不同的指示蛋白。
7、在一些实施方案中，本发明包括用于检测样品中的目标微生物的方法，该方法包括以下步骤：将样品与感染目标微生物的重组噬菌体一起孵育，其中所述重组噬菌体包含插入到噬菌体的晚期基因区域中的指示基因，使得在宿主细菌感染后的噬菌体复制过程中指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物，以及检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明目标微生物存在于样品中。
8、在制备重组指示噬菌体的方法的一些实施方案中，野生型噬菌体是克罗诺杆菌属之种的特异性噬菌体，目标致病菌是克罗诺杆菌属种。在一些实施方案中，野生型噬菌体特异性感染先前被分类为阪崎肠杆菌(enterobacter sakazakii)的细菌。在一些实施方案中，分离重组噬菌体的特定克隆包括用于分离展示指示基因表达的克隆的有限稀释测定。
9、本发明的其他方面包括用于检测样品中的细菌诸如克罗诺杆菌属种的方法，其包括以下步骤:将样品与源自克罗诺杆菌属特异性噬菌体的重组噬菌体一起孵育，并检测由重组噬菌体产生的指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明克罗诺杆菌属种存在于样品中。在一些实施方案中，本发明包括使用来源于靶向克罗诺杆菌属种的噬菌体的重组噬菌体检测克罗诺杆菌属种的方法。样品可以是食物或水样品。
10、在用于检测细菌的方法的一些实施方案中，首先将样品在有利于生长的条件下孵育24小时或更少、23小时或更少、22小时或更少、21小时或更少、20小时或更少、19小时或更少、18小时或更少、17小时或更少、16小时或更少、15小时或更少、14小时或更少、13小时或更少、12小时或更少、11小时或更少，10小时或更少，或9小时或更少，8小时或更少，7小时或更少，6小时或更少，5小时或更少，4小时或更少，3小时或更少，或2小时或更少的富集期。在一些实施方案中，检测之前不富集样品。在一些实施例中，达到结果的总时间少于26小时、25小时、24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时或2小时。在一些实施例中，通过检测指示剂产生的信号与背景的比率为至少2.0或至少2.5或至少3.0。在一些实施方式中，该方法在食品安全行业标准尺寸的样品中检测到少至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个特定细菌。
11、其他实施方案包括用于检测克罗诺杆菌属种的系统和试剂盒，其中所述系统或试剂盒包括源自克罗诺杆菌特异性噬菌体的重组噬菌体。一些实施方案还包括用于与指示剂反应以检测重组噬菌体表达的可溶性蛋白产物的底物。这些系统或试剂盒可包括针对本发明的噬菌体、组合物和方法所描述的特征。在其他实施方案中，本发明包括用于根据本发明的方法或系统的非瞬态计算机可读介质。
1.一种重组噬菌体，其包含插入所述噬菌体基因组的晚期基因区内的指示基因，其中所述重组噬菌体特异性感染克罗诺杆菌属种(cronobacter spp.)。
2.权利要求1的重组噬菌体，其中所述重组噬菌体源自野生型saka2、saka4或saka10噬菌体。
3.权利要求1的重组噬菌体，其中所述指示基因是密码子优化的，并编码产生内在信号的可溶性蛋白产物或与底物反应后产生信号的可溶性酶。
4.权利要求1的重组噬菌体，其还包括所述密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其中所述非翻译区包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
5.一种包含至少两种不同类型的重组噬菌体的混合组合物，其中至少一种所述重组噬菌体包含根据权利要求1的指示基因。
6.一种制备重组指示噬菌体的方法，其包括:
7.权利要求6的方法，其中制备同源重组质粒/载体包括:
8.权利要求7的方法，其中设计序列还包括在密码子优化的指示基因上游插入包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点的非翻译区。
9.权利要求8的方法，其中所述同源重组质粒在所述密码子优化的指示基因的上游包含非翻译区，所述非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
10.权利要求8的方法，其中所述野生型噬菌体是克罗诺杆菌属特异性噬菌体，并且所述目标致病菌是克罗诺杆菌属种。
11.权利要求8的方法，其中分离重组噬菌体的特定克隆包括分离显示所述指示基因表达的克隆的有限稀释测定。
12.一种检测样品中克罗诺杆菌属种的方法，其包括：
13.权利要求12的方法，其中所述样品是食品、环境、水或商业样品。
14.权利要求12的方法，其中所述方法在食品安全行业标准尺寸的样品中检测少至10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或单个细菌。
15.权利要求14的方法，其中所述食品样品包括肉、鱼、蔬菜、鸡蛋、乳制品、干食品或婴儿配方粉。
16.权利要求12的方法，其中将所述样品与包含至少两种不同类型的重组噬菌体的混合组合物一起孵育，其中至少一种所述重组噬菌体包含根据权利要求12的指示基因。
17.权利要求16的方法，其中首先将所述样品在有利于生长的条件下孵育少于24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时或2小时的富集期。
18.权利要求16的方法，其中获得结果的总时间少于26小时、25小时、24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时或2小时。
19.权利要求12的方法，其中通过检测所述指示剂产生的信号与背景的比率为至少2.0或至少2.5。
20.一种检测克罗诺杆菌属种的试剂盒，其包含源自克罗诺杆菌属特异性噬菌体的重组噬菌体。
21.权利要求20的试剂盒，其还包含用于与指示剂反应以检测由所述重组噬菌体表达的可溶性蛋白产物的底物。
22.一种检测克罗诺杆菌属种的系统，其包含源自克罗诺杆菌属特异性噬菌体的重组噬菌体。
