本发明涉及一种培养基，特别是一种黑曲霉液体发酵高效表达溶血磷脂酶的发酵培养基以及发酵方法。
背景技术：
1、溶血磷脂酶具有广泛的用途。可应用于食品、油脂、日化、纺织等工业。在工业化生产中，pla可来源于毕氏酵母等单核微生物的表达，也可来源于丝状真菌等多核微生物的表达。与毕氏酵母等单细胞相比，丝状真菌因其菌丝细长和分枝在液体培养时易于缠绕结团，导致氧的传递受限，从而严重限制了酶的表达。现有文献资料报导，在液体发酵时，丝状菌产溶血磷脂酶的酶活浓度普遍在10000u/ml以下，低的发酵酶活浓度要经过高倍浓缩才能达到商品酶制剂的要求。酶活浓度低下和培养时出现结团现象是整个曲霉发酵行业内的难点和痛点。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了新的黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的发酵培养基，使用该发酵培养基可以显著提高酶活浓度。
2、本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明提供了一种黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的发酵培养基，其特点是：每1l水中加入组分和配比如下的物质：
3、蛋白胨和平粒径为5μm的酵母粉30g、糊精40g、kh2po45g、
4、mgso4·7h2o 5g、na2hpo4·12h2o 1g、feso40.04g、znso40.06g、mnso4
5、0.1g、乳化硅油1g；酵母粉的添加量占蛋白胨和酵母粉总量的20％－80％。
6、本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明提供了另一种黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的发酵培养基，其特点是：每1l水中加入组分和配比如下的物质：
7、蛋白胨30g、糊精40g、kh2po45g、mgso4·7h2o 5g、na2hpo4·12h2o
8、1g、feso40.04g、znso40.06g、mnso40.1g、平均粒径为30μm的泡敌粉1g－6g。
9、本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明提供了再一种黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的发酵培养基，其特点是：每1l水中加入组分和配比如下的物质：
10、酵母粉6g－24g、蛋白胨24g－6g、糊精40g、kh2po45g、mgso4·7h2o5g、na2hpo4·12h2o 1g、feso40.04g znso40.06g、mnso40.1g、泡敌粉1g－6g；酵母粉和蛋白胨合计30g。
11、本发明所述的黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的发酵培养基，其进一步优选的技术方案是是：每1l水中加入组分和配比如下的物质：
12、蛋白胨15g、酵母粉15g、糊精40g、kh2po45g、mgso4·7h2o 5g、na2hpo4·12h2o 1g、feso40.04g、znso40.06g、mnso40.1g、平均粒径为30μm的泡敌粉3g－6g。
13、本发明所述的黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的发酵培养基，其进一步优选的技术方案是是：每1l水中加入组分和配比如下的物质：
14、蛋白胨15g、酵母粉15g、糊精40g、kh2po45g、mgso4·7h2o 5g、na2hpo4·12h2o 1g、feso40.04g、znso40.06g、mnso40.1g、泡敌粉4g。
15、本发明所述的黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的发酵培养基，其进一步优选的技术方案是是：所述的发酵培养基的各原料加入后，混匀，121℃灭菌20min制得。
16、本发明还提供了一种黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的方法，其特征在于：该方法采用本发明中任何一项所述的发酵培养基，其具体步骤如下：
17、(1)将保存于-80℃超低温冰箱的黑曲霉孢子悬液涂布于pda产孢固体培养基上，28℃、培养7d，无菌水制备孢子悬液备用；
18、(2)摇瓶发酵：取上述孢子悬液接种于装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶，接种量为104个孢子/ml，摇床28℃，200rpm培养8d；
19、(3)发酵：取上述孢子悬液接种于装有发酵培养基的发酵罐，接种量为104个孢子/ml，发酵罐28℃，通气量为0.5vvm，转速为850rpm培养6d；
20、(4)酶活的检测方法：发酵液抽滤后，滤液稀释一定的倍数与磷脂乳化液反应，催化分解使底物ph降低；反应一段时间后，用95％乙醇灭活滤液以终止反应；随后以酚酞作为指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定，进而计算出酶活力。
21、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
22、1、本发明提供了3种黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的培养基，其最显著的特点是分别或者同时使用了平均粒径范围为5μm酵母粉和平均粒径范围为30μm泡敌粉的配方。平均粒径为5μm的培养基为酵母粉(酵母粉具有完整的细胞壁，不同于破壁浸提的可溶性酵母提取物，在培养体系中以悬浮粒子的形态存在)。平均粒径为30μm的培养基为泡敌粉(不同于液体消泡剂，在培养体系中亦以悬浮粒子的形态存在)。酵母粉与泡敌粉除了提供培养体系的粒度外，同时还兼具氮源和消泡剂的功效，在这两种粒径的颗粒作用下，培养体系变得稳定，同时菌丝在深层液体培养时有所攀附而自然的分散伸展开，无论是摇瓶发酵还是发酵罐发酵，菌丝都从舒展状慢慢形成均匀疏松的小球，这样的疏松的小菌丝球不影响氧的传递，使得氧易于传递至细胞的中心，高效表达了酶活。
23、2、本发明通过优选调节了酵母粉与泡敌粉的添加量，来提高发酵酶活浓度。
24、3、本发明最优的技术方案采用平均粒径范围为5μm酵母粉和30μm泡敌粉配方组合，用来解决黑曲霉发酵体系不稳定的问题，使菌丝体形成均匀疏松的菌丝小球，避免了丝状真菌在液体培养时菌丝缠绕结团的现象发生，在此基础上的发酵工艺能够实现从摇瓶发酵成功稳定的放大，酶活单位达60000u/ml以上。
1.一种黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的发酵培养基，其特征在于：每1l水中加入组分和配比如下的物质：
2.一种黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的发酵培养基，其特征在于：每1l水中加入组分和配比如下的物质：
3.一种黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的发酵培养基，其特征在于：每1l水中加入组分和配比如下的物质：
4.根据权利要求3所述的黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的发酵培养基，其特征在于：每1l水中加入组分和配比如下的物质：
5.根据权利要求3所述的黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的发酵培养基，其特征在于：每1l水中加入组分和配比如下的物质：
6.根据权利要求1－4中任何一项所述的黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的发酵培养基，其特征在于：所述的发酵培养基的各原料加入后，混匀，121℃灭菌20min制得。
7.一种黑曲霉液体发酵产溶血磷脂酶的方法，其特征在于：该方法采用权利要求1－4任何一项所述的发酵培养基，其具体步骤如下：
