本发明属于生物，涉及一种动物脑组织细胞核的提取方法及其应用。
背景技术：
1、大脑是神经系统最为高级的部分，负责接收并发出各种指令。有关大脑的研究极具挑战。现有技术下，单细胞方法使我们能够研究细胞间的异质性。然而，在大脑物质中，很难分离出单个细胞。另一方面，由于组织部位的限制，脑类取样相对困难，涉及到不同物种的脑组织时，比如人类，从意外去世或者因疾病去世后病人处所获得的正常和疾病组织，是研究大脑组织中细胞类型的主要样本类型，但是，这些组织通常是冰冻的样本；此外，对于脑组织来说，scrna-seq并不能全面地分析神经细胞的类型，一些细胞类型更容易受到组织解离过程的影响。相反，细胞核对机械处理更有抵抗力，可以从冷冻组织中解离出来。因此单细胞核转录组测序的出现极大地解决了这个问题，为一些珍稀冻存样品提供了单细胞水平研究应用平台，可挖掘更多潜在的致病细胞类型，更易于探讨肿瘤细胞异质性和致病机理。
2、目前报道的脑组织细胞核提取的方法较多，但由于脑类研究较为细化，不同部位的脑区组织量较少，因此对核得率以及数据指标要求更高。
3、综上所述，亟需提供一种适用于多个物种，及不同部位的脑组织，且核得率较高，对样本需求量较少的动物脑组织细胞核提取的方法。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明的目的在于提供一种动物脑组织细胞核的提取方法及其应用，以适用于多个物种的脑组织的单细胞核提取。
2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供了一种动物脑组织细胞核的提取方法，所述提取方法包括：
4、将脑组织与脑组织细胞核提取液混合均质定容后离心，去上清，使用脑组织细胞核提取液重悬沉淀，重悬沉淀后与缓冲液a混合均质再次离心，去除上清，使用重悬缓冲液重悬沉淀，过滤得到滤液，定容滤液得到提取液，离心提取液后所得沉淀即为动物脑组织细胞核；
5、所述脑组织细胞核提取溶液包括：表面活性剂、盐离子溶液、化学缓冲液、蔗糖、还原剂和抑制剂。
6、本发明的动物脑组织细胞核提取方法适用于多个物种及不同部位的脑组织，可以极大满足多种物种及不同部位、不同组织量的脑的单细胞核提取，可去除大量杂质，得到较干净的核，获得的核得率较高，且对样本量需求较低，能够满足部分组织量较低脑区的提核需求。
7、优选地，所述脑组织与脑组织细胞核提取液的质量体积比为5-50mg:1ml。
8、上述5-50mg中的具体点值可以选择5mg、6mg、7mg、10mg、20mg、40mg、50mg等。
9、优选地，所述表面活性剂包括igepal ca-630。
10、优选地，所述盐离子溶液包括氯化钙溶液和醋酸镁溶液。
11、优选地，所述化学缓冲液包括tris-hcl缓冲液。
12、优选地，所述还原剂包括乙二胺四乙酸。
13、优选地，所述抑制剂包括核糖核酸酶抑制剂。
14、优选地，所述脑组织细胞核提取液中表面活性剂的质量百分含量为0.05-0.2％，例如可以为0.05％、0.06％、0.07％、0.1％、0.15％、0.18％、0.19％、0.2％等。
15、优选地，所述脑组织细胞核提取液中氯化钙的浓度为1-10mm，醋酸镁的浓度为2-4mm，例如可以为2mm、2.2mm、2.4mm、3mm、3.8mm、3.9mm、4mm等。
16、优选地，所述脑组织细胞核提取液中tris-hcl缓冲液的浓度为8-12mm，例如可以为8.5mm、9mm、9.5mm、10mm、10.5mm、11mm、11.5mm等。
17、优选地，所述脑组织细胞核提取液中蔗糖的浓度为300-400mm，例如可以为300mm、301mm、302mm、310mm、320mm、360mm、390mm、395mm、400mm。
18、优选地，所述肠组织核解离液中乙二胺四乙酸的浓度为0.05-0.5mm，例如可以为0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.10mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm等。
19、优选地，所述脑组织细胞核提取液中核糖核酸酶抑制剂的酶活浓度为0.1-0.3u/μl，例如可以为0.1u/μl、0.15u/μl、0.2u/μl、0.25u/μl、0.3u/μl等。
20、优选地，所述缓冲液a包括蔗糖、mg(ac)2、tris-hcl和无酶水。
21、优选地，所述缓冲液a中蔗糖的浓度为1-2m，例如可以为1m、1.1m、1.2m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、2m等。
22、优选地，所述缓冲液a中mg(ac)2的浓度为1-5mm，例如可以为1mm、1.1mm、1.2mm、1.4mm、1.5mm、2mm、3mm、4mm、4.5mm、4.8mm、5mm等。
23、优选地，所述缓冲液a中tris-hcl的浓度为5-15mm，例如可以为5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、14mm、15mm等。
24、优选地，所述重悬缓冲液包括核糖核酸酶抑制剂、胎牛血清和pbs。
25、优选地，所述重悬缓冲液中的核糖核酸酶抑制剂的最终浓度为0.1-0.3u/μl，例如可以为0.1u/μl、0.15u/μl、0.2u/μl、0.25u/μl、0.3u/μl等。
26、优选地，所述重悬缓冲液中的胎牛血清的质量百分比为1％-3％，例如可以为1％、1.5％、2％、2.5％、3％等。
27、优选地，所述重悬缓冲液的ph为7.2-7.6，例如可以为7.2、7.3、7.4、7.5、7.6等。
28、优选地，所述离心、再次离心和离心提取液的的离心转速各自独立地为3500-4500rpm(例如可以为3500rpm、3800rpm、4000rpm、4200rpm等)、3500-4500rpm和400-600rcf(例如可以为440rcf、480rcf、520rcf、560rcf等)，温度各自独立地为3-5℃(例如可以为3.5℃、4℃、4.5℃等)，时间各自独立地为4-6min(例如可以为4.5min、5min、5.5min等)。
29、作为本发明优选的技术方案，所述动物脑组织细胞核的提取方法包括如下步骤：
30、(1)脑组织与脑组织细胞核提取液按照5-50mg:1ml的比例混合，将脑组织匀浆，匀浆后使用脑组织细胞核提取液定容，3000-5000rpm、3-5℃离心4-6min；
31、所述脑组织核解离液包括0.05-0.2％igepal ca-630、1-10mm cacl2、2-4mm mg(ac)2、8-12mm tris-hcl、300-400mm蔗糖、0.05-0.5mm乙二胺四乙酸、0.1-0.3u/μl核糖核酸酶抑制剂和无酶水；
32、(2)去除上清，使用脑组织细胞核提取液重悬沉淀，重悬沉淀后与缓冲液a混合均质得到提取物，4000rpm、3-5℃离心4-6min，去除上清，使用重悬缓冲液定容，得到提取液；
33、(3)将所述提取液进行35-45μm滤网过滤，所得滤液将所述提取液进行400-600rcf、3-5℃离心4-6min，离心后所得沉淀使用重悬缓冲液进行重悬，所得溶液即为所述动物脑组织细胞核悬液。
34、第二方面，本发明提供了一种用于脑组织细胞核提取的缓冲液a，所述缓冲液a包括：1-2m蔗糖、1-5mm mg(ac)2、5-15mm tris-hcl，所述缓冲液a的溶剂包括无酶水。
35、第三方面，本发明提供了一种用于脑组织细胞核提取的重悬缓冲液，所述重悬缓冲液包括：1-3％的胎牛血清、0.1-0.3u/μl核糖核酸酶抑制剂，所述重悬缓冲液的溶剂包括pbs。
36、第四方面，本发明提供了一种脑组织细胞核提取液，所述脑组织细胞核提取液包括：0.05-0.2％igepal ca-630、1-10mm cacl2、2-4mm mg(ac)2、8-12mm tris-hcl、300-400mm蔗糖、0.05-0.5mm乙二胺四乙酸、0.1-0.3u/μl核糖核酸酶抑制剂和无酶水。
37、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
38、第五方面，本发明提供了一种动物脑组织细胞核悬液，所述动物脑组织细胞核悬液中的动物脑组织细胞核采用如第一方面所述的提取方法制备得到。
39、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
40、(1)本发明方法适用于不同物种及不同部位的脑区，适用性较广；
41、(2)脑组织中因含髓鞘，解离后杂质特别多，本发明方法可去除大量杂质，得到较干净的核；
42、(3)本发明方法获得的核得率较高，且对样本量需求较低，能够满足部分脑区组织量较低的需求。
1.一种动物脑组织细胞核的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述脑组织与脑组织细胞核提取液的质量体积比为5-50mg:1ml；
3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述脑组织细胞核提取液中表面活性剂的质量百分含量为0.05-0.2％；
4.根据权利要求1-3任一项所述的提取方法，其特征在于，所述缓冲液a包括蔗糖、mg(ac)2、tris-hcl和无酶水；
5.根据权利要求1-4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述离心、再次离心和离心提取液的的离心转速各自独立地为3500-4500rpm、3500-4500rpm和400-600rcf，温度各自独立地为3-5℃，时间各自独立地为4-6min。
6.根据权利要求1-5任一项所述的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括如下步骤：
7.一种脑组织细胞核提取液，其特征在于，所述脑组织细胞核提取液包括：0.05-0.2％igepal ca-630、1-10mm cacl2、2-4mm mg(ac)2、8-12mm tris-hcl、300-400mm蔗糖、0.05-0.5mm乙二胺四乙酸、0.1-0.3u/μl核糖核酸酶抑制剂和无酶水。
8.一种用于脑组织细胞核提取的缓冲液a，其特征在于，所述缓冲液a包括：1-2m蔗糖、1-5mm mg(ac)2、5-15mm tris-hcl，所述缓冲液a的溶剂包括无酶水。
9.一种用于脑组织细胞核提取的重悬缓冲液，其特征在于，所述重悬缓冲液包括：1-3％的胎牛血清、0.1-0.3u/μl核糖核酸酶抑制剂，所述重悬缓冲液的溶剂包括pbs。
10.一种动物脑组织细胞核悬液，其特征在于，所述动物脑组织细胞核悬液中的动物脑组织细胞核采用如权利要求1-6任一项所述的提取方法制备得到。
