本发明属于生物，涉及一种用于检测apoe基因分型的引物、方法及应用。
背景技术：
1、载脂蛋白e(apolipoprotein e，apoe)是血浆中最重要的载脂蛋白之一，由299个氨基酸残基构成，分子量约为34kd，主要在肝脏合成、分泌和代谢，参与脂质运输、存储及代谢。apoe基因位于19号染色体，是一个多态性蛋白，存在两个重要的单核苷酸多态性，即526c>t(rs7412)和388t>c(rs429358)，形成三个常见的异构体，即apoe2(cys112cys158)、apoe3(cys112arg158)和apoe4(arg158arg112)3个等位基因，可以形成6种不同的基因型：3种纯合子(e2/e2、e3/e3、e4/e4)和3种杂合子(e2/e3、e2/e4、e3/e4)，另外还有一种潜在的等位基因可能既双突变型(arg112cys158)，近年来研究结果表明，apoe基因多态性与多种疾病有关。apoe基因的分型在疾病预测、预防、个体化用药等方面具有重大的价值。
2、目前，临床主要使用qpcr和sanger测序的方法进行apoe基因分型，这些检测方法需要测序试剂或检测探针，检测成本高；操作步骤繁琐，实验过程中易发生错误；判读方法复杂，需要先对两个snp进行检测，再根据检测结果进行基因型判断，分析过程易出错，且当2个snp位点都是杂合子时无法判断是e2/e4型还是e3/双突变型，总之无法快速精准的进行分型检测。
3、cn105525002a公开了一种检测apoe基因多态性的引物及其方法，此发明提供的apoe基因多态性的引物，包括pcr扩增引物和基于荧光标记单碱基延伸pcr引物，主要针对中等通量的snp分型。但是无法有效区分e2/e4型和e3/双突变型两种基因型。
4、因此，亟需提供一种准确性高，特异性强，分型结果直观，能有效区分e2/e4型和e3/双突变型两种基因型的apoe基因分型检测方法。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于检测apoe基因分型的引物、方法及应用，通过arms-pcr结合片段分析的方法，开发了一种成本低，准确性高，可直接检测apoe等位基因，并可实现机器直接判读的apoe检测方法，避免了分析过程中的错误发生，判读过程更加直观准确，实现大批量自动判读，单管内即可完成检测，无需合成探针，无需测序，大幅降低了检测成本。
2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供了一种用于检测apoe基因分型的引物组合，所述用于检测apoe基因分型的引物组合包括引物apoe-mf、引物apoe-wf、引物apoe-wr和引物apoe-mr；
4、所述引物apoe-mf为针对rs429358位点突变型c碱基的特异性上游引物，在3’端第三位碱基引入错配；
5、所述引物apoe-wf为针对rs429358位点野生型t碱基的特异性上游引物，在3’端第三位碱基引入错配，同时在5’端引物8-12个额外碱基(例如9个额外碱基、10个额外碱基、11个额外碱基)；
6、所述引物apoe-mr为针对rs7412位点突变型t碱基的特异性下游引物，在3’端第三位碱基引入错配；
7、所述引物apoe-wr为针对rs7412位点野生型的c碱基特异性下游引物，在3’端第三位碱基引入错配，同时在5’端引物4-6个额外碱基(例如4个额外碱基、5个额外碱基、6个额外碱基)。
8、所述引物apoe-wr为针对rs7412位点野生型c碱基的特异性下游引物，在3’端第三位碱基引入错配；
9、所述引物apoe-mr为针对rs7412位点突变型的t碱基特异性下游引物，在3’端第三位碱基引入错配，同时在5’端引物4-6个额外碱基。
10、本发明中通过arms-pcr结合片段分析的方法，开发了一种成本低，准确性高，可直接检测apoe等位基因，并可实现机器直接判读的apoe检测方法，避免了分析过程中的错误发生，判读过程更加直观准确，实现大批量自动判读，单管内即可完成检测，无需合成探针，无需测序，大幅降低了检测成本。
11、突变扩增阻滞-pcr(arms-pcr)技术能够提高检测的准确性和特异性，通过arms引物的特异性扩增，可针对apoe的四种等位基因扩增出四种长度不同的产物，并通过产物长度分析的方法直接判断等位基因类型。
12、优选地，所述检测apoe基因分型的引物组合包括seq id no:1-seq id no:4所示序列。
13、seq id no:1：
14、ttttttttttcgcggacatggaggacgagt。
15、seq id no:2：
16、cgcggacatggaggacgggc。
17、seq id no:3：
18、ggcctggtacactgccagacg。
19、seq id no:4：
20、ttttcggcctggtacactgccagtca。
21、第二方面，本发明提供了第一方面所述的用于检测apoe基因分型的引物组合在制备用于检测apoe基因分型的产品中的应用。
22、第三方面，本发明提供了一种apoe基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测apoe基因分型的引物组合中的任意一种或至少两种的组合。
23、第四方面，本发明提供了第一方面所述的用于检测apoe基因分型的引物组合在检测apoe基因分型中的应用。
24、第五方面，本发明提供了检测apoe基因分型的方法，所述检测apoe基因分型的方法包括：从待测样本中提取dna作为模板，利用第一方面所述的检测apoe基因分型的引物组合进行等位基因特异性扩增，对扩增产物进行片段长度分析，根据扩增产物的片段长度分析结果判断apoe基因分型结果。
25、优选地，所述apoe基因分型包括：apoe基因e2型、apoe基因e3型或apoe基因e4型中的任意一种。
26、优选地，所述检测apoe基因分型的引物组合包括seq id no:1-seq id no:4所示序列。
27、优选地，所述等位基因特异性扩增的反应体系包括：dna聚合酶、检测apoe基因分型的引物组合和gc碱基增强剂。
28、优选地，所述等位基因特异性扩增的反应程序包括：93-95℃(例如93℃、94℃、95℃)，8-10min(例如8min、9min、10min)；93-95℃(例如93℃、94℃、95℃)，20-30s(例如20s、25s、30s)，60-62℃(例如60℃、61℃、62℃)，20-30s(例如20s、25s、30s)，70-72℃(例如70℃、71℃、72℃)，1-2min(例如1min、2min)，共30-40个循环(例如30个循环、35个循环、40个循环)；70-72℃(例如70℃、71℃、72℃)，5-7min(例如5min、6min、7min)。
29、在本发明的一个实施例中，以seq id no:1-seq id no:4所示序列的引物组合进行检测apoe基因分型时，判断的标准为：
30、(1)当扩增产物的长度为191-193bp时，判断apoe基因分型为e2型；
31、(2)当扩增产物的长度为186-188bp时，判断apoe基因分型为e3型；
32、(3)当扩增产物的长度为175-178bp时，判断apoe基因分型为e4型；
33、(4)当扩增产物的长度为183bp时，判断apoe基因分型为双突变型。
34、apoe基因位于19号染色体，是一个多态性蛋白，存在两个重要的单核苷酸多态性，即526c>t(rs7412)和388t>c(rs429358)，形成三个常见的异构体，即apoe2(cys112cys158)、apoe3(cys112arg158)和apoe4(arg158arg112)3个等位基因，可以形成6种不同的基因型：3种纯合子(e2/e2、e3/e3、e4/e4)和3种杂合子(e2/e3、e2/e4、e3/e4)，另外还有一种潜在的等位基因可能即双突变型(arg112cys158)。
35、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
36、(1)本发明的引物和检测方法能够在单管内直接对apoe的3种单倍型进行分型，分型结果直观的转化为片段长度的差异，避免了传统分型先分析2个snp分型结果再判断基因型的过程，同时也可有效区分e2/e4型和e3/双突变型两种基因型；
37、(2)本发明的检测方法与qpcr方法相比，不需要合成昂贵的分型探针，与sanger测序法相比，无需后续的测序过程和判读过程，检测更加快速，直观，成本更低，准确性更高。
1.一种用于检测apoe基因分型的引物组合，其特征在于，所述用于检测apoe基因分型的引物组合包括引物apoe-mf、引物apoe-wf、引物apoe-wr和引物apoe-mr；
2.根据权利要求1所述的用于检测apoe基因分型的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括seq id no:1-seq id no:4所示序列。
3.权利要求1或2所述的用于检测apoe基因分型的引物组合在制备用于检测apoe基因分型的产品中的应用。
4.一种apoe基因分型检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的用于检测apoe基因分型的引物组合中的任意一种或至少两种的组合。
5.权利要求1或2所述的用于检测apoe基因分型的引物组合在检测apoe基因分型中的应用。
6.一种检测apoe基因分型的方法，其特征在于，所述检测apoe基因分型的方法包括：从待测样本中提取dna作为模板，利用权利要求1或2所述的检测apoe基因分型的引物组合进行等位基因特异性扩增，对扩增产物进行片段长度分析，根据扩增产物的片段长度分析结果判断apoe基因分型结果。
7.根据权利要求6所述的检测apoe基因分型的方法，其特征在于，所述apoe基因分型包括：apoe基因e2型、apoe基因e3型或apoe基因e4型中的任意一种。
8.根据权利要求6或7所述的检测apoe基因分型的方法，其特征在于，所述检测apoe基因分型的引物组合包括seq id no:1-seq id no:4所示序列。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的检测apoe基因分型的方法，其特征在于，所述等位基因特异性扩增的反应体系包括：dna聚合酶、检测apoe基因分型的引物组合和gc碱基增强剂。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的检测apoe基因分型的方法，其特征在于，所述等位基因特异性扩增的反应程序包括：93-95℃，8-10min；93-95℃，20-30s，60-62℃，20-30s，70-72℃，1-2min，共30-40个循环；70-72℃，5-7min。
