本发明涉及一种基于多重pcr扩增的长江江豚环境dna检测方法，属于分子生物学。
背景技术：
1、长江生态保护是维护国家生态安全、推动绿色发展的重要组成部分，长江江豚是我国一级保护野生动物，是长江现存唯一的哺乳类动物，作为长江水生态系统中的标志性和旗舰物种，其种群动态是长江生态环境质量状况的重要表征。过去几十年，在流域人类活动的强烈干扰下，长江渔业资源下降、江湖阻隔、水质恶化，长江江豚栖息地恶化趋势明显，种群数量持续衰减，被iucn濒危物种红色名录列为极度濒危。
2、对长江江豚种群数量及分布进行持续监测是开展有效保护的科学基础，但由于长江江豚体型小、出水面积有限、出水时间短、聚群较小且游速快，这些生物学特征对传统监测方法的灵敏性、准确性和监测效率提出挑战。环境dna(edna)技术是一种新兴生物监测手段，它通过分析生物体释放到周围环境(如水、土壤等)中的微量dna，来检测和量化各种生物的存在，无需直接观察或捕捉目标生物。该技术具有非侵入性、高灵敏度和能够处理复杂样本的能力等，已成为生物多样性监测、生态系统调查和物种保护的重要工具，尤其在珍稀濒危物种的监测中展现出了显著的适用性和优势。
3、近年来，关于长江江豚环境dna监测研究已有相关报道，证明了该监测技术方法的有效性。但目前的研究中开发的长江江豚环境dna引物均为单位点分子标记，鉴于长江江豚种群的稀有性，在dna模板浓度低的情况下，pcr扩增的随机性会使得基于单位点扩增的环境dna技术的灵敏性和准确性下降。因此，针对珍稀濒危物种设计多个位点物种特异性环境dna引物，可以显著提高珍稀濒危物种环境dna检测结果的灵敏性和准确性，而多位点分子标记的开发及多重pcr扩增方法体系的建立是研究关键。
技术实现思路
1、本发明主要解决的技术问题是提供一种基于多重pcr扩增的长江江豚环境dna检测方法，该基于多重pcr扩增的长江江豚环境dna检测方法利用多重pcr技术检测长江江豚环境dna的多位点引物组合，检测长江江豚环境dna的存在，具有较高的特异性、灵敏性和准确性。
2、为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种基于多重pcr扩增的长江江豚环境dna检测方法，包括以下步骤：
3、(1)利用多重pcr方法建立检测长江江豚环境dna用的引物组合；
4、(2)水样抽提：采集水样，然后用微孔滤膜抽滤水样，抽滤后将滤膜放至灭菌离心管；
5、(3)edna提取：利用ctab法提取滤膜上的edna；
6、(4)多重pcr扩增：利用步骤(1)中所述的引物组合对提取所得edna进行多重pcr扩增反应，得到扩增产物；
7、(5)电泳检测：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像仪中观察亮带情况，根据是否出现目标片段的亮带判断有无长江江豚的存在。
8、优选的，步骤(1)中所述的引物组合的核苷酸序列如下：
9、seq id no.1f：gattgggacttacaggctcc；
10、seq id no.1r：ttggagtagcgcgaagagg；
11、seq id no.2f：gcattactactttccatcctcatcc；
12、seq id no.2r：ggctgacctccgattcatgt；
13、seq id no.3f：ctcgcaacctctctactagac；
14、seq id no.3r：cgggtggtcgttgtttattgg；
15、seq id no.4f：ggcatccctctaaccacagg；
16、seq id no.4r：caagagcagtgtagtggtggt。
17、优选的，步骤(1)中，根据原始引物浓度对引物进行等比例混合，混合后的引物组合中每条引物浓度为2μm。
18、优选的，步骤(2)中所述滤膜为混合纤维素膜，滤膜孔径为0.45微米。
19、优选的，步骤(4)中，多重pcr扩增的反应体系包括：多重pcr预混液25ul、edna模板10ul，引物组合5μl，无菌无酶水补足至50μl。
20、优选的，步骤(4)中，多重pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95.0℃变性30s、60℃退火90s、72℃延伸30s，循环反应40次；最后68℃延伸10min。
21、本发明还提供了一种长江江豚环境dna检测试剂盒，其特征在于，包含上述的检测长江江豚环境dna用的引物组合。
22、优选的，上述的检测试剂盒还包括多重pcr预混液，所述多重pcr预混液为包含dntp、mg2+等组分的常规的用于多重pcr反应的缓冲液。
23、本发明还提供了上述引物组合在进行长江江豚环境dna检测鉴定长江江豚物种中的应用。
24、本发明的有益效果是：本发明的基于多重pcr扩增的长江江豚环境dna检测方法基于分子生物学方法，创新了环境dna引物设计方法，以鼠海豚科主要物种线粒体基因组序列比较分析为基础，围绕环境dna引物基本要求，设计开发了长江江豚多位点分子标记，得到一组由多对引物组合的长江江豚环境dna多位点引物，结合优化的pcr反应体系和条件，能够在长江江豚潜在生活水域检测出长江江豚dna，特异性强，准确性好，灵敏度高，突破了单位点环境dna技术在珍稀濒危物种模板浓度较低时存在的假阴性结果的局限，大大提升了检测效率和精度。
1.基于多重pcr扩增的长江江豚环境dna检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于多重pcr扩增的长江江豚环境dna检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的引物组合的核苷酸序列如下：
3.根据权利要求2所述的基于多重pcr扩增的长江江豚环境dna检测方法，其特征在于，步骤(1)中，根据原始引物浓度对引物进行等比例混合，混合后的引物组合中每条引物浓度为2μ m。
4.根据权利要求3所述的基于多重pcr扩增的长江江豚环境dna检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述滤膜为混合纤维素膜，滤膜孔径为0.45微米。
5.根据权利要求4所述的基于多重pcr扩增的长江江豚环境dna检测方法，其特征在于，步骤(4)中，多重pcr扩增的反应体系包括：多重pcr预混液25ul、edna模板10ul，引物组合5μl，无菌无酶水补足至50μl。
6.根据权利要求5所述的基于多重pcr扩增的长江江豚环境dna检测方法，其特征在于，步骤(4)中，多重pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95.0℃变性30s、60℃退火90s、72℃延伸30s，循环反应40次；最后68℃延伸10min。
