本发明涉及制备季铵化多糖，具体涉及一种季铵化普鲁兰多糖的制备方法及其在制备止血产品中的应用。
背景技术：
1、普鲁兰多糖是一种由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖，该多糖是由α-1,4糖苷键连接的麦芽三糖重复单位经α-1,6糖苷键聚合而成的直链状多糖，分子量为2-200万。普鲁兰多糖的成膜性、阻气性、可塑性、粘性均较强，并且具有易溶于水、无毒无害、无色无味等优良特性，已广泛应用于医药、食品、轻工、化工、石油等领域。在医药领域，普鲁兰多糖主要用于伤口敷料、血浆增量剂、疫苗、创口缝合线等的制备中。
2、伤口的快速止血和愈合对人类的生命保障和身体健康都有十分重要的影响，使得伤口护理材料的研究备受关注。其中，从动植物中提取或由生物基单体合成而得的生物基高分子材料，由于具有良好的物理性能、生物活性、生物相容性、生物降解性、生物可吸收性等优点，在制备为止血产品后，能够具有止血、杀菌、保护、促进伤口愈合等功能。在将普鲁兰多糖用于止血产品时，目前最常用的方法为将普鲁兰多糖直接制成止血海绵，但是由于普鲁兰多糖本身的抗菌性能、吸水性能、止血性能一般，影响了止血海绵的使用效果。
3、对于上述问题，最主要的解决方法为对普鲁兰多糖进行改性，常用的改性方法有季铵化改性、羧甲基化、羟丙基化等，其中，季铵化改性为在缚酸剂的作用下，使用季铵化试剂在普鲁兰多糖上引入季铵盐基团，得到季铵化普鲁兰多糖。季铵化普鲁兰多糖中的季铵盐基团能够通过破坏病原微生物细胞膜的细胞膜、干扰病原微生物细胞膜的酶系统、使病原微生物的蛋白质凝固和变性，实现优异的抗菌效果和止血效果，且季铵盐基团本身的亲水性较强，因此，季铵化普鲁兰多糖在伤口敷料的制备领域具有广阔的应用前景。
4、但是在将普鲁兰多糖进行季铵化改性时，存在的主要问题为由于季铵盐基团的体积要远远大于羟基的体积，在取代羟基时存在空间位阻，且普鲁兰多糖上的羟基的反应活性较低，导致制备的季铵化普鲁兰多糖的季铵基取代度低，进一步地，影响了季铵化普鲁兰多糖的抗菌效果和止血效果；为了解决前述问题，目前最常用的方法为增加季铵化试剂的用量或延长季铵化改性时间，但是会导致季铵化普鲁兰多糖的制备成本提高或制备时间延长。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种季铵化普鲁兰多糖的制备方法及其在制备止血产品中的应用，能够提高季铵化普鲁兰多糖的季铵基取代度，降低季铵化试剂的用量，缩短季铵化普鲁兰多糖的制备时间，进一步地，提高季铵化普鲁兰多糖的抗菌效果和止血效果。
2、为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：
3、一种季铵化普鲁兰多糖的制备方法，由以下步骤组成：制备助剂，季铵化，后处理；
4、所述制备助剂，由以下步骤组成：酸化，钠离子化；
5、所述酸化的方法为，将浓硝酸、碳纳米管混合后进行超声震荡，控制超声震荡的频率为20-30khz，时间为30-40min，然后在120-130℃下以100-200rpm的搅拌速度回流搅拌18-20h，过滤取滤渣，使用去离子水清洗5-7次，在70-80℃下真空烘干，得到酸化碳纳米管；
6、所述酸化中，浓硝酸、碳纳米管的质量体积比为1800-2000ml:50-55g；
7、所述浓硝酸的质量浓度为68%；
8、所述碳纳米管的内径为5nm，外径为15nm，长度为20μm；
9、所述钠离子化的方法为，将酸化碳纳米管、氢氧化钠水溶液混合后，在室温下以100-200rpm的搅拌速度搅拌20-30min，过滤取滤渣，使用去离子水清洗5-7次，在70-80℃下真空烘干，得到助剂；
10、所述钠离子化中，酸化碳纳米管、氢氧化钠水溶液的质量体积比为50-52g:3000-3500ml；
11、所述氢氧化钠水溶液的质量浓度为2%；
12、所述季铵化的方法为，将普鲁兰多糖、第一份去离子水混合后，在室温下以50-100rpm的搅拌速度搅拌50-60min，加入异丙醇、第一份氢氧化钠水溶液、助剂，在室温下以50-100rpm的搅拌速度搅拌1.5-2h，加入第一份2,3-环氧丙基三甲基氯化铵水溶液，加入结束后在55-60℃下以200-300rpm的搅拌速度搅拌回流7-8h，加热至75-80℃后，趁热过滤，取滤液作为一次滤液；将滤渣与第二份去离子水混合后，在室温下以25-30khz的频率超声震荡25-30min，过滤，取滤液作为二次滤液；将一次滤液与二次滤液合并，然后与第二份氢氧化钠水溶液混合，在55-60℃下以200-300rpm的搅拌速度搅拌回流10-15min，加入第二份2,3-环氧丙基三甲基氯化铵水溶液，加入结束后在55-60℃下以200-300rpm的搅拌速度搅拌回流4-4.5h，得到反应液；
13、所述季铵化中，普鲁兰多糖、第一份去离子水、异丙醇、第一份氢氧化钠水溶液、助剂、第一份2,3-环氧丙基三甲基氯化铵水溶液、第二份去离子水、第二份氢氧化钠水溶液、第二份2,3-环氧丙基三甲基氯化铵水溶液的质量体积比为48-50g:450-500ml:120-160ml:15-18ml:3-3.2g:960-1040ml:120-130ml:14-16ml:480-550ml；
14、所述第一份氢氧化钠水溶液与第二份氢氧化钠水溶液的质量浓度均为40%；
15、所述第一份2,3-环氧丙基三甲基氯化铵水溶液与第二份2,3-环氧丙基三甲基氯化铵水溶液的质量浓度均为10%；
16、所述普鲁兰多糖的重均分子量为20万；
17、所述第一份2,3-环氧丙基三甲基氯化铵水溶液的加入速度为20-30ml/min；
18、所述第二份2,3-环氧丙基三甲基氯化铵水溶液的加入速度为30-40ml/min；
19、所述后处理的方法为，向反应液中加入冰醋酸将ph调节至7后，加入截留分子量为8000的透析袋中，将透析袋中置于水中进行透析48-60h以除去小分子杂质，每6-7h换一次水，透析结束后，将透析袋内的透析液在-45℃至-40℃下冷冻干燥，得到季铵化普鲁兰多糖。
20、一种由前述的制备方法得到的季铵化普鲁兰多糖在制备止血产品中的应用。
21、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
22、（1）本发明的季铵化普鲁兰多糖的制备方法，在季铵化中加入了助剂，从而提高了季铵化普鲁兰多糖的季铵基取代度。助剂的制备方法由酸化和钠离子化组成，其中，酸化为使用浓硝酸对碳纳米管进行酸化，在碳纳米管表面引入大量羧基和羟基，钠离子化为使用氢氧化钠对碳纳米管进行处理，氢氧化钠与碳纳米管表面的羧基反应生成羧基钠，羧基钠为碱性，在季铵化过程中加入了助剂，第一方面能够起到缚酸剂的作用，促进反应的进行，第二方面能够通过表面的羟基与普鲁兰多糖的部分羟基之间形成氢键，从而能够对普鲁兰多糖的分子构型和羟基活性造成影响，从而降低季铵化的难度，提高季铵基取代度，第三方面，助剂表面的羟基直接与碳纳米管相连，空间位阻要远远大于普鲁兰多糖中的羟基，从而避免了由于助剂表面的羟基被季铵化造成的季铵化试剂损失；然后通过加热和超声震荡破坏氢键并去除助剂后，释放出新的羟基，继续加入季铵化试剂，季铵化试剂与释放出的羟基继续进行反应，从而能够提高季铵化普鲁兰多糖的季铵基取代度，降低季铵化试剂的用量，缩短季铵化普鲁兰多糖的制备时间；
23、（2）本发明的季铵化普鲁兰多糖的制备方法，制备的季铵化普鲁兰多糖的季铵基取代度为0.303-0.320；
24、（3）本发明的季铵化普鲁兰多糖的制备方法，季铵化时间短，季铵化试剂用量小；
25、（4）本发明的季铵化普鲁兰多糖的制备方法，制备的季铵化普鲁兰多糖的抑菌能力强；
26、（5）本发明的季铵化普鲁兰多糖的制备方法，制备的季铵化普鲁兰多糖的止血能力强，具体表现为具有优秀的凝血能力、低溶血率、红细胞粘附率和血小板粘附率。
1.一种季铵化普鲁兰多糖的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：制备助剂，季铵化，后处理；
2.根据权利要求1所述的季铵化普鲁兰多糖的制备方法，其特征在于，所述酸化中，浓硝酸、碳纳米管的质量体积比为1800-2000ml:50-55g；
3.根据权利要求1所述的季铵化普鲁兰多糖的制备方法，其特征在于，所述钠离子化中，酸化碳纳米管、氢氧化钠水溶液的质量体积比为50-52g:3000-3500ml；
4.根据权利要求1所述的季铵化普鲁兰多糖的制备方法，其特征在于，所述季铵化中，普鲁兰多糖、第一份去离子水、异丙醇、第一份氢氧化钠水溶液、助剂、第一份2,3-环氧丙基三甲基氯化铵水溶液、第二份去离子水、第二份氢氧化钠水溶液、第二份2,3-环氧丙基三甲基氯化铵水溶液的质量体积比为48-50g:450-500ml:120-160ml:15-18ml:3-3.2g:960-1040ml:120-130ml:14-16ml:480-550ml。
5.根据权利要求1所述的季铵化普鲁兰多糖的制备方法，其特征在于，所述季铵化中，所述第一份氢氧化钠水溶液与第二份氢氧化钠水溶液的质量浓度均为40%；
6.根据权利要求1所述的季铵化普鲁兰多糖的制备方法，其特征在于，所述季铵化中，所述第一份2,3-环氧丙基三甲基氯化铵水溶液的加入速度为20-30ml/min；
7.根据权利要求1所述的季铵化普鲁兰多糖的制备方法，其特征在于，所述后处理中，透析袋的截留分子量为8000；
8.一种由权利要求1-7任一项的制备方法得到的季铵化普鲁兰多糖在制备止血产品中的应用。
