本发明涉及定点突变hog1p在提高酿酒酵母利用木糖产乙醇中的应用，属于生物工程领域。
背景技术：
1、酿酒酵母（ saccharomyces cerevisiae），具有生长周期短、发酵能力强、容易进行大规模培养，环境适应性强等优点，是生产燃料乙醇的理想菌株，但由于其缺乏有效的木糖利用途径，只能利用木质纤维素水解液中的葡萄糖，而不能利用木糖（占木质纤维素水解糖的18~30%），限制了其纤维乙醇生产中的应用。木质纤维素预处理过程中产生的多种抑制物对酿酒酵母的生长及葡萄糖木糖代谢产生较大负面影响。因此，提高酿酒酵母高效利用木质纤维素预处理液中葡萄糖木糖和对抑制物的耐受性是利用酿酒酵母高效转化燃料乙醇的基本要求。全球科学家通过途径工程、适应性驯化等策略使酿酒酵母的葡萄糖木糖共利用能力和对抑制物的耐受性分别得到较明显地提升。然而，越来越多的研究表明，酿酒酵母的木糖代谢能力更容易受到抑制物的影响，提高酿酒酵母对抑制物耐受性的增加往往伴随着木糖利用能力的显著下降，反之亦然（bellissimi, e., van dijken, j.p., et al.,2009. effects of acetic acid on the kinetics of xylose fermentation by anengineered, xylose-isomerase-based saccharomyces cerevisiaestrain. fems yeastres. 9(3), 358-364.; demeke, m.m., dumortier, f., li, y.y., et al., 2013.combining inhibitor tolerance and d-xylose fermentation inindustrial saccharomyces cerevisiaefor efficient lignocellulose-basedbioethanol production. biotechnol. biofuels. 6 (1), 120.; wei, f., li, m.,wang, m., li, h., et al., 2021. a c6/c5 co-fermenting saccharomyces cerevisiaestrain with the alleviation of antagonism between xyloseutilization and robustness. gcb bioenergy 13 (1), 83-97.），酿酒酵母的木糖代谢能力和对抑制物的耐受性往往呈现此消彼长的拮抗现象，同一菌株很难同时呈现较强的木糖代谢能力和较高的耐受性，这也是酿酒酵母在利用木质纤维素原料生产二代燃料乙醇过程中存在的技术瓶颈，相关机制尚未被研究清楚。
2、酿酒酵母促分裂原活化蛋白激酶hog1p是酿酒酵母中应对高渗透压胁迫环境应答的主要调控因子，通过介导高渗透性甘油促分裂原激酶（hog-mapk）信号通路、调控相关基因表达、介导细胞周期阻滞等机制，显著提升酿酒酵母的抗逆性和增强细胞对外界不利环境的适应能力。在高渗透压条件下，酿酒酵母通过渗透传感复合体sln1p-ypd1p-ssk1p和膜结合的sho1p系统接收信号，然后通过ssk2p/ssk22p将信号传递给pbs2p，被激活的pbs2p通过对hog1p的thr-174和tyr-176双重磷酸化激活hog1p，磷酸化的hog1p进入细胞核内，以调控渗透相关的基因表达应对胁迫，一般来说正常条件下hog1p主要分布于细胞质中，当受到胁迫刺激后hog1p的thr-174和tyr-176被pbs2p磷酸化，磷酸化的hog1p易位到细胞核中，调控胁迫应答相关基因的表达。当细胞重新适应环境蛋白磷酸酶ptp1p、ptp2p会与hog1p相互作用，从而使hog1p去磷酸化，hog1p重新分布到细胞核中。
3、hog1p包含激酶结构域，cd结构域（common docking）和pbd-2结构域（pbs2-binding domain），其中激酶结构域结构域位于第23位至第302位氨基酸，该结构域的thr-174和tyr-176可被pbs2p磷酸化，从而激活hog1p的表达。酿酒酵母定点突变hog1p激酶结构域中第237位脯氨酸在缓解酿酒酵母木糖利用和乙酸耐受性之间的拮抗现象方面的积极作用尚无报道，也没有其促进酿酒酵母在含有乙酸条件下转化木糖生成乙醇相关的报道。
技术实现思路
1、由于酿酒酵母内在调控机制的复杂性，酿酒酵母在利用木质纤维素原料生产二代燃料乙醇过程中，其木糖代谢和对抑制物的耐受性往往存在此消彼长的现象，同一菌株很难同时呈现较强的木糖代谢能力和较高的耐受性，这也是酿酒酵母在利用木质纤维素原料生产二代燃料乙醇过程中存在的技术瓶颈。本发明提供了定点突变hog1p在提高酿酒酵母利用木糖或木质纤维素产乙醇中的应用。
2、本发明的技术方案如下：
3、定点突变hog1p在提高酿酒酵母利用木糖产乙醇中的应用，其特征在于，所述hog1p第237位脯氨酸定点突变为甘氨酸，定点突变后hog1p的氨基酸序列如seq id no. 1所示，具体为：mttneefirtqifgtvfeitnryndlnpvgmgafglvcsatdtltsqpvaikkimkpfstavlakrtyrelkllkhlrhenliclqdiflsplediyfvtelqgtdlhrllqtrplekqfvqyflyqilrglkyvhsagvihrdlkpsnilinencdlkicdfglariqdpqmtgyvstryyrapeimltwqkydvevdiwsagcifaemiegkplfpgkdhvhqfsiitdllgspgkdvinticsentlkfvtslphrdpipfserfktvepdavdllekmlvfdpkkritaadalahpysapyhdptdepvadakfdwhfndadlpvdtwrvmmyseildfhkiggsdgqidisatfddqvaaataaaaqaqaqaqaqvqlnmaahshngagttgndhsdiaggnkvsdhvaandtitdygnqaiqyanefqq。
4、上述将hog1p第237位脯氨酸定点突变为甘氨酸，可以提高酿酒酵母在纯木糖培养基中产乙醇的得率。
5、上述将hog1p第237位脯氨酸定点突变为甘氨酸，提高酿酒酵母在含有乙酸的木糖培养基中的乙醇得率，显著降低副产物甘油的产生。
6、定点突变hog1p在提高酿酒酵母利用木质纤维素产乙醇中的应用，其特征在于，所述hog1p第237位脯氨酸定点突变为甘氨酸，定点突变后hog1p的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7、本发明具有如下技术效果：
8、（1）能提高酿酒酵母菌株在纯木糖培养基中的木糖利用和乙醇产生，乙醇得率提高了72.4%。
9、（2）能加快酿酒酵母在含有2.5 g/l乙酸的木糖培养基中的木糖和乙酸消耗，乙醇得率提高了25.8%，基本没有副产物甘油的产生。
10、本发明为克服酿酒酵母利用木质纤维素生产二代燃料乙醇过程中存在的技术瓶颈提供了理论依据。
1. 定点突变hog1p在提高酿酒酵母利用木糖产乙醇中的应用，其特征在于，所述hog1p定点突变是将第237位脯氨酸突变为甘氨酸，其hog1p突变后的氨基酸序列如seq id no. 1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，提高酿酒酵母在纯木糖培养基中的乙醇得率。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，提高酿酒酵母在含有乙酸的木糖培养基中利用木糖产生乙醇的得率。
