本发明涉及生物，更具体地涉及一种利用两亲性dna进行上转换纳米颗粒转相及dna偶联的方法。
背景技术：
1、在基因药物递送领域，上转换纳米颗粒可用于负载核酸药物介导基因沉默、基因治疗和基因编辑等应用。然而，在体内或体外应用上转换纳米颗粒时，它往往容易受到复杂的生物体系环境而产生聚集现象。维持上转换纳米颗粒在生物体系中的稳定分散对于确保药物的有效输送和目标基因的表达至关重要。因此，进行疏水纳米颗粒的稳定相转移是实现有效核酸药物递送的关键挑战之一。
2、目前用于上转换纳米颗粒相转移及表面核酸偶联的方法通常包括物理吸附和化学修饰。疏水上转换纳米颗粒表面的油酸配体可通过盐酸等试剂洗下，未带配体修饰的上转换纳米颗粒表面带正电，可通过静电吸附作用与带负电的dna相连，提高上转换纳米颗粒的水溶性。然而，该方法需要耗费大量的dna，造成更高的成本，此外，该方法所获得的上转换纳米颗粒球形核酸易受生物体系影响产生dna脱落现象，造成负载药物泄露，不利于药物的可控释放。通过化学反应进行纳米颗粒表面配体修饰（如氨基、羧基、叠氮等）可增强其水溶性。然而，化学修饰常常需要特殊的合成步骤，操作复杂且效率较低。
3、这些方法的弊端限制了上转换纳米颗粒在核酸药物递送中的应用。因此，开发一种更简便、高效、且无需特殊要求的方法来制备水相分散良好的上转换纳米颗粒球形核酸的需求变得更为迫切。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种利用两亲性dna进行上转换纳米颗粒转相及dna偶联的方法，从而解决现有技术中疏水颗粒无法在生物体系中均匀分散或者存在dna偶联步骤复杂效率偏低等弊端。
2、为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
3、根据本发明的第一方面，提供一种利用两亲性dna进行上转换纳米颗粒转相及dna偶联的方法，包括以下步骤：s1，通过在dna单链核糖主链的2’位引入烷烃侧链，合成一种具有多条烷烃侧链修饰的两亲性dna分子；s2，用少量dmso溶液溶解步骤s1中合成的两亲性dna分子，随后加入氯仿超声使所述两亲性dna分子完全溶解；s3，提供一种均匀分散在环己烷中的上转换纳米颗粒，用三倍体积乙醇将上转换纳米颗粒沉淀下来，用氯仿重悬；s4，将步骤s3中所得上转换纳米颗粒与s2步骤中所得两亲性dna分子混合均匀，超声分散，使用水相缓冲液重悬，所述dna分子的烷烃侧链和上转换纳米颗粒表面的疏水油酸通过配体嵌插的作用相结合，获得一种两亲性dna分子修饰的上转换纳米颗粒，即可同时实现上转换纳米颗粒的转相及dna偶联。
4、优选地，步骤s1中，所述dna单链的长度为6~200个碱基，可根据实际需要设计相应的碱基序列。
5、优选地，步骤s1中，所述烷烃侧链来自前体dmtr-2’-o-c16-ra(bz)-3’-ce-phosphoramidite。
6、优选地，步骤s1中，所述烷烃侧链为十六烷烃或十八烷烃。
7、优选地，步骤s1中，通过设计使烷烃侧链等间隔地均匀分布在dna单链上。
8、应当理解的是，步骤s1中，所述dna单链具有烷烃链和dna链的两种特性，即烷烃链的疏水性和dna材料的亲水性，因此本发明将其作为一种两亲性化合物同时溶于有机相和水相环境。
9、优选地，步骤s2中，所述dmso溶液的体积含量为3~10%，用来提高所述两亲性dna在氯仿中的溶解度。
10、优选地，步骤s3中，所述上转换纳米颗粒的表面配体选自油酸、油胺、1-十八烯中的至少一种。
11、优选地，步骤s4包括：将步骤s3中所得上转换纳米颗粒与s2步骤中所得两亲性dna分子混合均匀，于30~60℃水浴10~20分钟，减压离心挥发有机溶剂，使用水相缓冲液重悬，即可将上转换纳米颗粒从有机相中转换至水相中，实现上转换纳米颗粒在水相中的均匀分散。
12、步骤s4中，优选地，分别用水、1×tae缓冲液、pbs缓冲液、25 mm hepes缓冲液、1640培养基、dmem培养基重悬dna修饰上转换纳米颗粒，可观察修饰有两亲性dna分子的上转换纳米颗粒在不同生物体系中的分散程度。
13、根据本发明的第二方面，提供一种根据上述方法制得的修饰有两亲性dna分子的上转换纳米颗粒。
14、根据本发明的第三方面，提供一种利用两亲性dna进行上转换纳米颗粒转相及dna偶联的方法在核酸药物的递送、以及核酸药物的可控释放中的应用。
15、上转换纳米颗粒（ucnps）是一类具有独特光学性质的纳米颗粒，它们能够将低能量光子（如近红外光）转换为高能量光子，通常在可见光或紫外线光谱中。这种现象被称为上转换发光。ucnps通常由掺杂稀土离子的主体材料组成，如钇（y）、镱（yb）和铒（er）。这些纳米颗粒具有在生物医学成像、生物标记和其他光学应用中非常有用的性质。本发明并不限制上转换纳米颗粒的材料成分。
16、还值得注意的是，一切尺寸合适（10~20纳米）的上转换纳米颗粒均适用于本发明，而根据本发明的一个优选方案，作为举例而非限制，选定粒径~15 纳米的核壳结构上转换纳米颗粒nayf4：0.05% tm, 30% yb@nayf4作为验证材料。
17、在常用的上转换纳米颗粒的合成方法中，可通过高沸点溶剂中稀土离子有机盐（如醋酸钇、醋酸铥等）的热分解合成上转换纳米颗粒。稀土离子有机盐在300℃左右高温热分解的过程中，长链碳氢化合物和相关官能团（如油酸溶剂中的cooh）常被用作高沸点合成溶剂防止纳米颗粒的聚集。因此，所合成的上转换纳米颗粒表面被油酸配体均匀包裹，在环己烷中有良好分散性，因此环己烷常用作上转换纳米颗粒的保存溶剂。
18、根据本发明所提供的方法，其工作原理为：在有机相中，上转换纳米颗粒因表面油酸配体包裹而均匀分散，当接触两亲性dna的疏水烷烃链时，由于烷烃链与油酸配体具有相似的分子结构（油酸分子式：c18h34o2，烷烃链分子式：c16h33），根据相似相溶原理，疏水烷烃链可通过配体嵌插的方式连接至颗粒表面，而dna链的亲水端则朝向外界。当溶剂置换后，颗粒在亲水dna的包裹下均匀分散至水相中，在盐环境中维持纳米颗粒的均匀分散。
19、值得注意的是，该方法所使用的dna单链的序列信息对纳米颗粒的转相几乎不产生影响，任意片段的两亲性dna均适用于本发明。
20、根据本发明的一个优选方案，提供一种利用两亲性dna制备生物体系稳定分散上转换纳米颗粒的方法，包括以下步骤：1）使用三倍体积乙醇将分散在环己烷中的上转换纳米颗粒沉淀下来，离心收集纳米颗粒，并用氯仿重悬；2）将氯仿（含5% dmso助溶）溶解的两亲性dna分子与1）中上转换纳米颗粒混合，超声分散，置于水浴中50℃孵育10 分钟；3）将2）中的反应溶液置于45℃环境中减压离心，挥发有机溶剂，并用0.5×tbe超声重悬；4）通过琼脂糖凝胶电泳的方式检验颗粒表面是否存在dna，通过tem成像表征颗粒在上述反应过程中的聚集状态，通过紫外吸收光谱检验颗粒表面dna的吸收情况，判断颗粒表面是否修饰dna分子；5）通过多次离心的方式替换上转换纳米颗粒的分散体系，分别置于多种常用生物体系缓冲液或细胞培养基中超声分散，通过tem成像观察颗粒分散情况。
21、其中，步骤1）所述纳米颗粒溶剂置换方法为本领域常规技术手段。向均匀分散在环己烷中的纳米颗粒分三次加入同等体积的乙醇溶液，加入后振荡混匀，根据乙醇与环己烷极性的差异，纳米颗粒可从环己烷中析出，在9000rpm离心作用下沉淀收集。该方法操作简便，可降低纳米颗粒的离心损失。
22、其中，步骤4）所述琼脂糖凝胶电泳检测方法为本领域常规技术手段。将步骤3）中体系取出20 µl上样至1% 琼脂糖胶孔，设定电泳电压恒定为90v，使用0.5×tbe作为跑胶缓冲液，电泳45分钟，使用gelred核酸染料进行dna染色与示踪，观察纳米颗粒在修饰dna前后的条带位置，判断表面dna上载情况。
23、其中，步骤4）和5）所述tem成像为本领域常规技术手段。向普通碳支持膜铜网表面滴加10 µl不同阶段纳米颗粒溶液，进行透射电子显微成像，可观察纳米颗粒在不同体系下的分散情况。
24、其中，步骤4）中所述紫外吸收光谱表征颗粒表面dna为本领域常规技术手段。通过多次离心的方式除去过量dna，重悬沉淀，检测颗粒重悬物中是否有260 nm处的dna紫外吸收特征峰，用于确认颗粒表面dna的偶联情况。
25、根据本发明提供的一种利用两亲性dna进行上转换纳米颗粒相转移及dna偶联的方法，相对于现有技术的积极进步效果在于：本发明首次提出一种利用两亲性dna进行上转换纳米颗粒转相的方法，其中，该方法制备的上转换纳米颗粒球形核酸较其他方法的合成流程来说更加简便，同时通过相似相溶原则，不改变纳米颗粒的表面配体性质，仅通过表面核酸的作用实现纳米颗粒的转相。在实际应用中，根据本发明的研究发现，该dna修饰上转换纳米颗粒在多种生物体系常用缓冲液与培养基中均具有良好的分散能力。
26、综上所述，本发明提出了一种利用两亲性dna进行上转换纳米颗粒转相及dna偶联的方法，可以很好地提高纳米颗粒在生物体系中的分散稳定性；更重要地，本发明描述的方法可发挥上转换纳米颗粒的光学特性，在生物体系中实现核酸药物的递送及光学可控药物释放释放，具有良好的生物医学应用前景。
1.一种利用两亲性dna进行上转换纳米颗粒转相及dna偶联的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述dna单链的长度为6~200个碱基，可根据实际需要设计相应的碱基序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述烷烃侧链来自前体dmtr-2’-o-c16-ra(bz)-3’-ce-phosphoramidite。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述烷烃侧链为十六烷烃或十八烷烃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2中，所述dmso溶液的体积含量为3~10%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s3中，所述上转换纳米颗粒的表面配体选自油酸、油胺、1-十八烯中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s4包括：将步骤s3中所得上转换纳米颗粒与s2步骤中所得两亲性dna分子混合均匀，于30~60℃水浴10~20分钟，减压离心挥发有机溶剂，使用水相缓冲液重悬，即可将上转换纳米颗粒从有机相中转换至水相中，实现上转换纳米颗粒在水相中的均匀分散。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤s4中，分别采用水、1×tae缓冲液、pbs缓冲液、25 mm hepes缓冲液、1640培养基、dmem培养基重悬dna修饰上转换纳米颗粒，可观察修饰有两亲性dna分子的上转换纳米颗粒在不同生物体系或细胞培养基中的分散程度。
9.一种根据权利要求1-8中任意一项所述的方法制得的修饰有两亲性dna分子的上转换纳米颗粒。
10.一种根据权利要求1-8中任意一项所述的利用两亲性dna进行上转换纳米颗粒转相及dna偶联的方法在核酸药物的递送、以及核酸药物的可控释放中的应用。
