本发明涉及针对冠状病毒的免疫领域。在这方面，本发明提供了基于慢病毒的免疫原性剂，其适用于受试者，特别是人受试者的加强或靶向免疫治疗，基于：(i)用第一代针对sars-cov-2感染或疾病的疫苗接种，如针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白、mrna、腺病毒、灭活病毒或蛋白亚单位疫苗组合物，特别是基于蛋白或mrna的疫苗，或(ii)sars-cov-2诱导的或相关的疾病，所述受试者先前已发展出针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的免疫。因此，本发明涉及基于慢病毒的免疫原性剂，通过触发针对冠状病毒的粘膜体液和细胞免疫应答，包括长期免疫应答，其特别可以帮助克服现有针对sars-cov-2疫苗的缺陷，特别是可以有效克服在用现有第一代疫苗如蛋白、mrna、腺病毒、灭活病毒或蛋白亚单位疫苗，特别是蛋白或mrna疫苗免疫后观察到的免疫应答减弱或细胞记忆应答不足。
背景技术：
1、考虑：(i)冠状病毒疾病2019(covid-19)的持续大流行，(ii)第一代疫苗针对sars-cov-2的保护潜力的减弱，和(iii)新型病毒关注变体(voc)的不停出现，新型有效疫苗平台对于未来的初次或加强疫苗可能是关键的(全球covid-19疫苗接种-2022年的战略愿景，世界卫生组织，sage会议，2021年10月)。本发明人最近证明了当在多个临床前模型中用于全身初次免疫，接着鼻内(i.n.)加强免疫时，编码来自祖先sars-cov-2(lv::s)的刺突糖蛋白的全长序列的慢病毒接种载体(lv)的强大性能(ku mw,et al.cell host microbe,29(2),236-249e236,2021)。lv::s确保呼吸道针对祖先sars-cov-2和voc的完全(交叉)保护(ku mw,et al.embo mol med,e14459,2021)。此外，在新的转基因小鼠中，表达人血管紧张素转化酶2(hace2)并显示出空前的脑对sars-cov-2复制的允许，用lv::s进行i.n.加强免疫是中枢神经系统的完全保护所需的(ku mw,et al.embo mol med,e14459,2021)。lv::s旨在用作初级疫苗或加强剂，以增强和扩大针对新出现的具有免疫逃避潜力的voc的保护(juno ja,wheatley ak.nat med,27(11),1874-1875,2021)。
2、由第一代covid-19疫苗赋予的保护的持续时间尚未确定，用血清学实验室测试难以预测，并且在不同个体中和针对不同的voc是可变的。尽管接种率很高，但目前世界范围大流行病的恶化表明需要反复加强免疫，以确保针对covid-19的个体和集体免疫。在本文中，必须考虑多个额外同源剂量的第一代covid-19疫苗的安全性和潜在副作用，例如与对mrna疫苗中所含的聚乙二醇(peg)的过敏反应有关(castells mc,phillips ej.n engl jmed,384(7),643-649,2021)。重要的是，在各种感染性疾病的许多临床前模型中，不匹配的疫苗递送方法，即异源初次免疫-加强免疫形式，已被证明是比同源初次免疫-加强免疫方法更成功的策略(he q,et al.emerg microbes infect,10(1),629-637,2021；lu s.curropin immunol,21(3),346-351,2009；nordstrom p,et al.lancet reg health eur,100249,2021)。因此，开发针对covid-19的异源加强剂特别关注新型有效疫苗接种平台。lv::s疫苗候选物对于针对covid-19的预防性应用具有严重的潜力，主要是基于其强烈的诱导能力，不仅是强烈的中和体液应答，而且是强烈的保护性t细胞应答，其不受sars-cov-2voc中积累的逃逸突变的影响(ku mw,et al.embo mol med,e14459,2021)。
3、此外，已经观察到，随着第一代疫苗最初诱导的免疫，特别是针对新型voc的免疫的预防潜力降低，施用额外的疫苗剂量变得至关重要(全球covid-19疫苗接种-2022年的战略愿景，世界卫生组织，sage会议，2021年10月)。作为相同疫苗的额外剂量的替代，在异源初次免疫-加强免疫方案中组合疫苗平台可有希望获得保护功效(barros-martins j,etal.nat med,27(9),1525-1529,2021)。与同源疫苗剂量施用相比，异源初次免疫-加强免疫策略可更好地增强特异性适应性免疫应答和长期保护，而不触发/增强载体特异性免疫或对疫苗本身或赋形剂的可能反应原性加重的风险。此外，为了诱导最大的中和广度，刺突抗原的序列必须根据sars-cov-2voc出现的动力学而适应。此外，针对症状性sars-cov-2感染的保护主要与血清中和活性有关，而针对重度covid-19的保护涉及cd8+t细胞免疫。这些细胞具有细胞溶解病毒感染细胞的能力，特别是控制病毒复制并导致sars-cov-2感染的消退(sette a,crotty s.cell,184(4),861-880,2021)。因此，适当的b-和t-细胞疫苗平台，包括适应的刺突序列，在大流行的当前阶段是最感兴趣的。
4、发明人推理lv::s可能非常适于用作异源i.n加强疫苗，以增强和扩大针对sars-cov-2的保护，特别是针对已知和新出现的voc(包括但不限于sars-cov-2的alpha、beta、gamma、delta和omicron变体)，而早期接种的国家中的集体免疫在初始免疫完成后的仅几个月减弱，并且新的感染波正在增加(juno ja,wheatley ak.nat med,27(11),1874-1875,2021)。
5、用于本发明的lv尤其是非整合性的、非复制性的、非细胞致病性的和可忽略炎性的(hu b,tai a,wang p.immunol rev,239(1),45-61,2011；ku mw,charneau p,majlessil.expert rev vaccines,1-16,2021)。这些载体用来自水泡性口炎病毒(vsv-g)的异源糖蛋白假型化，这赋予它们对不同细胞类型，特别包括树突细胞的广泛向性。后者主要是非分裂细胞，因此几乎不允许基因转移。因此，lv具有将基因有效转移到非分裂细胞的细胞核中的核心性质，因此使树突细胞的有效转导成为可能。在这些细胞中产生的内源性抗原表达具有独特的激活天然t细胞的能力(guermonprez p,et al.j.int rev cell mol biol,349,1-54,2019)，与lv诱导高质量效应细胞和记忆t细胞的突出能力相关(ku mw,etal.commun biol,4(1),713,2021)。重要的是，vsv-g假型化还避免了lv成为人中预先存在的载体特异性免疫的靶标，这在疫苗开发中是关键的(hu b,tai a,wang p.immunol rev,239(1),45-61,2011；ku mw,charneau p,majlessi l.expert rev vaccines,1-16,2021)。在i/iia期人免疫缺陷病毒-1治疗性疫苗试验(欧盟临床试验登记，2011-006260-52临床试验)中已确定lv在人中的安全性。由于它们的非细胞致病性和非炎性特性(cousin c,etal.cell rep,26(5),1242-1257e1247,2019；lopez j,et al.an optimized lentiviralvector induces cd4+t-cell immunity and predicts a booster vaccine againsttuberculosis.in revision)，lv非常适合粘膜接种。i.n.施用途径具有公认的触发粘膜iga应答以及呼吸道中驻留记忆b和t淋巴细胞的优点(lund fe,randall td.science,373(6553),397-399,2021)。在仓鼠和猕猴的临床前模型中，该途径在减少sars-cov-2传播方面也显示为最有效(van doremalen n,et al.sci transl med,13(607),2021)。通过i.n.免疫诱导粘膜免疫允许sars-cov-2中和，在其进入主要的可感染的解剖部位之前，直接在宿主生物体的通道中(ku mw,et al.cell host microbe,29(2),236-249e236,2021)。
6、发明概述
7、在本发明中，发明人产生了编码beta变体的向下选择scov-2的lv，其通过scov-2(lv::sbeta-2p)的s2结构域中k986p和v987p取代来稳定。在小鼠中，用mrna-1273(moderna)疫苗肌内(i.m.)初次免疫和加强免疫，并且其中(交叉)血清中和潜力逐渐降低，本发明人比较了全身和粘膜免疫应答以及i.n.的lv::sbeta-2p异源加强免疫与i.m的mrna-1273(moderna)同源加强免疫的保护潜力(jackson la,et al.preliminary report.n engl jmed,383(20),1920-1931,2020；wang f,et al.med sci monit,26,e924700,2020)。相对于具有改进抗原设计的先前方案，本发明人观察到新型疫苗递送lv平台和替代i.n.施用途径的多个优点。
8、根据第一个方面，本发明因此涉及编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的刺突(s)蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其用作疫苗方案中的异源加强或靶向免疫剂，所述疫苗方案施用于受试者，特别是人受试者的上呼吸道，所述受试者接受了针对sars-cov-2感染或疾病的疫苗组合物的初次免疫，所述疫苗组合物选自由针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白、mrna、腺病毒、灭活病毒和蛋白亚单位疫苗组合物组成的组，特别是针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白或mrna疫苗组合物。根据本发明的针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白亚单位疫苗组合物的非限制性实例可以包括基于佐剂化重组刺突蛋白的疫苗或基于包装在纳米颗粒中的重组刺突蛋白的疫苗。
9、sars-cov-2病毒的刺突(s)蛋白在本领域中被完全鉴定为包膜锚定的糖蛋白(walls et al,2020,structure,function,and antigenicity of the sars-cov-2spikeglycoprotein.cell 181:281-292e286)。更准确地说，sars-cov-2s(scov-2)是一种(180kda)3同源三聚体i类病毒融合蛋白，其与在宿主细胞上表达的羧肽酶血管紧张素转化酶2(ace2)接合。scov-2蛋白的单体具有胞外结构域、跨膜锚定结构域和短内部尾。scov-2通过两步依次的蛋白水解切割被激活，以启动与宿主细胞膜的融合。在导致构象重组的scov-2-ace2相互作用之后，scov-2的胞外结构域首先在高度特异性弗林蛋白酶682rrar685(seq idno:21)位点被切割(guo et al.,2020,the origin,transmission and clinicaltherapies on coronavirus disease 2019(covid-19)outbreak-an update on thestatus.mil med res 7,11；walls et al.,2020)，这是决定病毒病理特征的关键因素，与普遍存在的弗林蛋白酶表达有关(wang et al.,2020a unique protease cleavage sitepredicted in the spike protein of the novel pneumonia coronavirus(2019-ncov)potentially related to viral transmissibility.virol sin2020jun；35(3):337-339.doi:10.1007/s12250-020-00212-7.epub 2020mar 20)。所得亚单位由以下组成：(i)s1，其具有ace2受体结合结构域(rbd)，与限制于ace2蛋白酶结构域的原子接触，并且还具有主要的b细胞表位，靶向中和抗体(nabs)(walls et al.,2020)，和(ii)s2，其具有膜融合元件。与scov-1一样，s1的脱落使得s2上第二蛋白水解切割位点797r可接近，即s2’(belouzard et al.,2009,activation of the sars coronavirus spike protein viasequential proteolytic cleavage at two distinct sites.proc natl acad sci u sa106:5871-5876)。根据细胞或组织类型，一种或多种宿主蛋白酶，包括弗林蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶或跨膜蛋白酶丝氨酸蛋白酶(tmprss)-2或-4，可以参与该第二切割步骤(coutard et al.,2020,the spike glycoprotein of the new coronavirus 2019-ncovcontains afurin-like cleavage site absent in cov of the same clade.antiviralres176:104742)。随后s的“融合(fusogenic)”构象变化导致scov-2的高度稳定的融合后形式，其起始与宿主细胞膜的融合反应(sternberg and naujokat,2020structuralfeatures of coronavirus sars-cov-2spike protein:targets for vaccination.lifesci 257,118056)，并导致邻近s2’的融合肽(fp)的暴露。将fp插入宿主细胞/囊泡膜引发融合反应，由此病毒rna释放到宿主细胞溶质中(lai et al.,2017the sars-cov fusionpeptide forms an extended bipartite fusion platform that perturbs membraneorder in a calcium-dependent manner.j mol biol 429:3875-3892)。事实上，scov-2-ace2相互作用是唯一的机制，迄今为止被鉴定为宿主细胞被sars-cov-2感染，并且rbd含有许多构象b细胞表位(walls et al.,2020)，指定该病毒包膜糖蛋白作为中和抗体(nabs)的主要靶标。
10、由本发明的慢病毒颗粒表达的s蛋白可以来源于sars-cov-2毒株，因此可以通过作为病毒蛋白天然序列的氨基酸序列来表征。在一个具体的实施方案中，本发明使用已知sars-cov-2毒株的s蛋白进行，如祖先毒株的s蛋白(其中氨基酸序列是seq id no:1)，或后来发现的变异株，如alpha毒株、beta毒株、gamma毒株、delta毒株和omicron毒株(都被认为是彼此的变异株)。
11、或者，本发明可以用s蛋白的衍生物进行，即通过在s蛋白的氨基酸序列中突变获得的天然s蛋白的衍生物，如本文将公开的。为了表达lv::s重组颗粒，编码s蛋白的核酸可以具有存在于起源病毒株中的基因序列，或者可以是适合在哺乳动物细胞，特别是人细胞中表达的密码子优化的核酸。为了表达表达s蛋白衍生物的lv重组颗粒，编码s蛋白衍生物的核酸可以具有存在于病毒株的s蛋白基因序列推导出的序列，并且可以是适合在哺乳动物细胞中表达的密码子优化的核酸。
12、在一个具体的实施方案中，用于本发明的重组慢病毒颗粒(lv)是基于hiv-1的慢病毒颗粒。因此，当本文使用表述“慢病毒颗粒”或“lv”时，其特别涉及基于hiv-1的慢病毒颗粒，尤其是用vsv-g蛋白假型化的lv颗粒，尤其是实施例中所示的lv。
13、根据本发明，表述“加强”或“加强免疫”或“加强施用”或“靶向免疫”是指在第一次施用异源免疫剂，特别是异源疫苗后，或在第二次或随后施用这种异源免疫剂或疫苗后，施用免疫原性剂。换句话说，根据本发明使用的免疫剂向先前接受初次免疫施用，或初次免疫和另外一次或多次施用剂量的针对相同sars-cov-2或其变异株的异源免疫剂或疫苗的受试者施用。加强或靶向免疫是通过对上呼吸道施用实现的，特别是作为鼻内施用，因此区别于第一代针对sars-cov-2感染或疾病的疫苗的施用途径，例如针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白、mrna、腺病毒、灭活病毒或蛋白亚单位疫苗组合物，特别是最常使用全身施用途径(包括肌内、皮内或皮下施用途径)的蛋白或mrna疫苗。加强或靶向免疫旨在增强、改善或延长先前产生的免疫应答，并可能扩大这种应答以引发针对多种sars-cov-2病毒的交叉中和。应答的改善可能是由于本发明中使用的免疫剂引发粘膜应答以及相应保护，不仅是全身部位，而且是上呼吸道和下呼吸道以及中枢神经系统这些可能没有被针对sars-cov-2感染或疾病的异源疫苗成功靶向或保护，所述异源疫苗例如针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白、mrna、腺病毒、灭活病毒或蛋白亚单位疫苗组合物，特别是通过全身途径注射的蛋白或mrna疫苗。在一个具体的实施方案中，加强免疫施用旨在提高受试者中针对新出现的病毒株的交叉中和免疫应答。在一个具体的实施方案中，加强或靶向免疫可以施用于接受了本文公开的异源免疫剂且已经从感染sars-cov-2或与这种感染相关的疾病如covid-19恢复的受试者。在以下描述中将公开与免疫剂的使用和受试者的治疗过程有关的其它特征。
14、施用于“上呼吸道”包括导致递送至上呼吸道的粘膜内层的任何类型的施用，并且特别包括鼻施用。对上呼吸道的施用包括但不限于气溶胶吸入、鼻滴注、鼻吹入及其所有组合。在一些实施方案中，施用是通过气溶胶吸入。在一些实施方案中，通过鼻滴注施用。在一些实施方案中，通过鼻吹入施用。
15、根据一个具体的实施方案，编码sars-cov-2s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒作为鼻内粘膜加强免疫或靶向免疫施用于接受了针对sars-cov-2感染或疾病的疫苗组合物的初次免疫施用的受试者，所述疫苗组合物选自由针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白、mrna、腺病毒、灭活病毒和抗蛋白亚单位疫苗组合物中组成的组，特别是针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白或mrna疫苗组合物。
16、根据一个具体的实施方案，本文公开的实施方案使用的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒的特征还在于以下特征：
17、-所述s蛋白来自对人宿主致病的sars-cov-2病毒，特别是(i)来自sars-cov-2病毒的s蛋白，所述sars-cov-2病毒选自由sars-cov-2祖先毒株、d614g毒株、alpha毒株、beta毒株、gamma毒株、delta毒株和omicron毒株组成的组，优选来自beta毒株或omicron毒株，更优选来自beta毒株，或(ii)来自所述祖先毒株、d614g毒株、alpha毒株、beta毒株、gamma毒株、delta毒株和omicron毒株的变体的s蛋白，其中所述变体编码具有与seq id no:1至少90％同一性的氨基酸序列的s蛋白，或
18、-所述s蛋白是所述祖先毒株、d614g毒株、alpha毒株、beta毒株、gamma毒株、delta毒株和omicron毒株之一的天然s蛋白的衍生物，通过突变1至12个、特别是1至6个氨基酸残基，特别是通过取代和/或缺失1至12个、特别是1至6个氨基酸残基，特别地，(a)是所述s蛋白的稳定化形式，其特征在于参考s蛋白的氨基酸序列中seq id no:1的残基986和987所提供的位置处，在s蛋白的s2结构域中用脯氨酸残基取代两个连续氨基酸残基，或(b)是所述s蛋白的融合前形式，其通过缺失位于s蛋白的氨基酸序列中参考seq id no:1的残基675至残基685的弗林蛋白酶位点，或(c)是所述s蛋白的稳定化融合前形式，其通过缺失所述弗林蛋白酶位点并参考seq id no:1的第986和987位，在s2结构域中用脯氨酸残基取代两个连续氨基酸残基。
19、在一个具体的实施方案中，sars-cov-2的祖先毒株的s蛋白具有seq id no:1的氨基酸序列且编码sars-cov-2的祖先毒株的s蛋白的多核苷酸的天然序列在seq id no:2中定义。
20、在另一个具体的实施方案中，编码sars-cov-2的d614g毒株的s蛋白的多核苷酸的天然序列包含seq id no:1的氨基酸序列的第614位天冬氨酸残基突变为甘氨酸残基(d614g)、seq id no:1的氨基酸序列的第986位赖氨酸残基突变为脯氨酸残基(k986p)和seq id no:1的氨基酸序列的第987位缬氨酸残基突变为脯氨酸残基(v987p)，即突变2p在seq id no:3(sd614g-2p)中定义。包含所述突变2p的sars-cov-2的d614g毒株的s蛋白(sd614g-2p)具有seq id no:4的氨基酸序列。
21、在另一个具体的实施方案中，编码sars-cov-2的alpha毒株的s蛋白的多核苷酸的天然序列包含seq id no:1的氨基酸序列的第986位赖氨酸残基突变为脯氨酸残基(k986p)和seq id no:1的氨基酸序列的第987位缬氨酸残基突变为脯氨酸残基(v987p)，即突变2p在seq id no:5(salpha-2p)中定义。包含所述突变2p的sars-cov-2的alpha毒株的s蛋白(salpha-2p)具有seq id no:6的氨基酸序列。
22、在另一个具体的实施方案中，编码sars-cov-2的beta毒株的s蛋白的多核苷酸的天然序列在seq id no:7(sbeta)中定义。sars-cov-2的beta毒株的s蛋白(sbeta)具有seq idno:8的氨基酸序列。
23、在另一个具体的实施方案中，编码sars-cov-2的beta毒株的s蛋白的多核苷酸的天然序列包含seq id no:1的氨基酸序列的第986位赖氨酸残基突变为脯氨酸残基(k986p)和seq id no:1的氨基酸序列的第987位缬氨酸残基突变为脯氨酸残基(v987p)，即突变2p在seq id no:9(sbeta-2p)中定义。包含所述突变2p的sars-cov-2的beta毒株的s蛋白(sbeta-2p)具有seq id no:10的氨基酸序列。
24、在另一个具体的实施方案中，编码sars-cov-2的gamma毒株的s蛋白的多核苷酸的天然序列包含seq id no:1的氨基酸序列的第986位赖氨酸残基突变为脯氨酸残基(k986p)和seq id no:1的氨基酸序列的第987位缬氨酸残基突变为脯氨酸残基(v987p)，即突变2p在seq id no:11(sgamma-2p)中定义。包含所述突变2p的sars-cov-2的gamma毒株的s蛋白(sgamma-2p)具有seq id no:12的氨基酸序列。
25、在另一个具体的实施方案中，编码sars-cov-2的delta毒株的s蛋白的多核苷酸的天然序列包含seq id no:1的氨基酸序列的第986位赖氨酸残基突变为脯氨酸残基(k986p)和seq id no:1的氨基酸序列的第987位缬氨酸残基突变为脯氨酸残基(v987p)，即突变2p在seq id no:13(sdelta-2p)中定义。包含所述突变2p的sars-cov-2的delta毒株的s蛋白(sdelta-2p)具有seq id no:14的氨基酸序列。
26、在另一个具体的实施方案中，编码sars-cov-2的omicron毒株的s蛋白的多核苷酸的天然序列在seq id no:15(somicron)中定义。sars-cov-2的omicron毒株的s蛋白(somicron)具有seq id no:16的氨基酸序列。
27、在另一个具体的实施方案中，编码sars-cov-2的omicron毒株的s蛋白的多核苷酸的天然序列包含seq id no:1的氨基酸序列的第986位赖氨酸残基突变为脯氨酸残基(k986p)和seq id no:1的氨基酸序列的第987位缬氨酸残基突变为脯氨酸残基(v987p)，即突变2p在seq id no:17(somicron-2p)中定义。包含所述突变2p的sars-cov-2的omicron毒株的s蛋白(somicron-2p)具有seq id no:18的氨基酸序列。
28、在另一个具体的实施方案中，编码sars-cov-2的omicron ba.1毒株的s蛋白的多核苷酸的天然序列在seq id no:23(somicron-ba.1)中定义。sars-cov-2的omicron毒株的s蛋白(somicron-ba.1)具有seq id no:24的氨基酸序列。
29、在另一个具体的实施方案中，编码sars-cov-2的omicron ba.4或ba.5毒株的s蛋白的多核苷酸的天然序列在seq id no:25(somicron-ba.4/5)中定义。sars-cov-2的omicronba.4或ba.5毒株的s蛋白(somicron-ba.4/5)具有seq id no:26的氨基酸序列。
30、在另一个具体的实施方案中，编码sars-cov-2的祖先毒株的s蛋白的多核苷酸的天然序列包含seq id no:1的氨基酸序列的第986位赖氨酸残基突变为脯氨酸残基(k986p)和seq id no:1的氨基酸序列的第987位缬氨酸残基突变为脯氨酸残基(v987p)，即突变2p在seq id no:19(s2p)中定义。包含所述突变2p的sars-cov-2的祖先毒株的s蛋白(s2p)具有seq id no:20的氨基酸序列。
31、在一个具体的实施方案中，假型慢病毒载体颗粒编码包含突变2p的sars-cov-2的beta毒株的s蛋白(sbeta-2p)，其由载体pflap-iecmv-s-b351-2p-wprem编码，所述载体于2021年7月6日以n℃ncm i-5710保藏于位于法国巴黎塞德克斯15区docteur roux街25-28号巴斯德研究所75724(institut pasteur,25-28rue du docteur roux,75724pariscedex 15)的国家微生物菌种保藏中心(collection nationale de culturesdemicroorganismes，cncm)。
32、还提供了载体pflap-iecmv-s-b351-2p-wprem(cncm i-5710)。pflap-iecmv-s-b351-2p-wprem的核苷酸序列在seq id no:22中定义。
33、还提供了包含载体pflap-iecmv-s-b351-2p-wprem(cncm i-5710或seq id no:22)的宿主细胞。
34、还提供了编码包含突变2p(sbeta-2p)的sars-cov-2的beta毒株的s蛋白的假型慢病毒载体颗粒，其中所述假型慢病毒载体颗粒通过包括用载体pflap-iecmv-s-b351-2p-wprem(cncm i-5710或seq id no:22)共转染宿主细胞的方法制备。
35、在一个具体的实施方案中，根据本文公开的实施方案的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒的特征还在于以下特征：s蛋白的氨基酸序列是seq id no:1或是具有与seq id no:1至少90％同一性的氨基酸序列的其衍生物，并且sars-cov-2的s蛋白的衍生物包含至少五个氨基酸突变，包括(i)seq id no:1的氨基酸序列的第417位赖氨酸残基突变为天冬酰胺残基(k417n)，(ii)seq id no:1的氨基酸序列的第484位谷氨酸残基突变为赖氨酸残基(e484k)或seq id no:1的氨基酸序列的第484位谷氨酸残基突变为丙氨酸残基(e484a)，(iii)seq id no:1的氨基酸序列的第501位天冬酰胺残基突变为酪氨酸残基(n501y)，(iv)seq id no:1的氨基酸序列的第986位赖氨酸残基突变为脯氨酸残基(k986p)，和(v)seq id no:1的氨基酸序列的第987位缬氨酸残基突变为脯氨酸残基(v987p)。
36、在一个具体的实施方案中，根据本发明的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒如此以使得sars-cov-2的s蛋白进一步包含选自以下的氨基酸突变：(vi)seq id no:1的氨基酸序列的第446位甘氨酸残基突变为丝氨酸残基(g446s)，(vii)seq id no:1的氨基酸序列的第478位苏氨酸残基突变为赖氨酸残基(t478k)，(viii)seq id no:1的氨基酸序列的第493位谷氨酰胺残基突变为精氨酸残基(q493r)，和(ix)seq id no:1的氨基酸序列的第498位谷氨酰胺残基突变为精氨酸残基(q498r)。
37、在一个具体的实施方案中，根据本发明的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒如此以使得sars-cov-2的经编码的突变s蛋白具有seq idno:10或seq id no:18，优选seq id no:10的氨基酸序列。
38、在另一个具体的实施方案中，根据本发明的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒如此以使得sars-cov-2的经编码的突变s蛋白具有seqid no:24或seq id no:26的氨基酸序列。
39、在一个具体的实施方案中，根据本发明的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒用水泡性口炎病毒糖蛋白g(vsv-g)蛋白假型化。
40、特别地，vsv-g蛋白有利地由印第安纳毒株或新泽西毒株的vs病毒提供。
41、在一个具体的实施方案中，根据本发明的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒如此以使得假型慢病毒载体颗粒是非整合的、非致细胞病变的和非复制的。
42、根据本文公开的本发明的免疫原性剂的用途，在一些实施方案中，免疫原性剂或包含其的组合物用于预防人受试者被sars-cov-2感染的方法。在一些实施方案中，免疫原性剂或组合物用于保护处于暴露于sars-cov-2或被sars-cov-2感染的风险中的人受试者中免受sars-cov-2复制的方法。在一些实施方案中，免疫原性组合物用于预防处于暴露于sars-cov-2或被sars-cov-2感染的风险中的人受试者中与sars-cov-2感染相关如covid-19的症状发展或疾病发展的方法。在一些实施方案中，免疫原性组合物用于预防处于暴露于sars-cov-2或被sars-cov-2感染的风险中的人受试者中与sars-cov-2感染相关的神经学结果的发作的方法。在一些实施方案中，免疫原性组合物用于保护处于暴露于sars-cov-2或被sars-cov-2感染的风险中的人受试者的中枢神经系统(cns)的方法。在一些实施方案中，疫苗提供免受sars-cov-2感染的保护，特别是杀菌保护。
43、在所公开的方法中使用的这些应用中的任一种中，免疫原性剂或组合物在加强或靶向施用步骤中作为预防性试剂向受试者施用，以有效量施用于上呼吸道以引发针对sars-cov-2的免疫应答。
44、在一些实施方案中，所述免疫原性组合物用于保护人受试者免受sars-cov-2感染或免受与sars-cov-2感染相关的症状或covid-19疾病的发展的方法，其中所述受试者处于发展肺和/或cns病理的风险中。特别是人受试者需要免疫保护cns以防sars-cov-2复制，因为他/她患有共生病症，特别是影响cns的共生病症。
45、在一个具体的实施方案中，将根据本文公开的任何一个实施方案的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒施用于选自以下的受试者：(a)先前已接受针对sars-cov-2感染或疾病的疫苗组合物的受试者，所述疫苗组合物选自由针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白、mrna、腺病毒、灭活病毒和蛋白亚单位疫苗组合物组成的组，特别是作为全身初次免疫和/或加强免疫施用如肌内、皮内或皮下施用，特别是肌内初次免疫和/或加强免疫施用的针对sars-cov-2感染或疾病的基于蛋白或mrna的疫苗，(b)已接受针对sars-cov-2感染或疾病的疫苗组合物的全身初次免疫施用如肌内、皮内或皮下施用，特别是肌内初次免疫施用，且然后已从冠状病毒疾病如冠状病毒疾病2019(covid-19)恢复的受试者，所述疫苗组合物由针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白、mrna、腺病毒、灭活病毒和蛋白亚单位疫苗组合物组成的组，特别是针对sars-cov-2感染或疾病的基于蛋白或mrna的疫苗组合物，(c)已首先从冠状病毒疾病如covid-19恢复，且然后已接受针对sars-cov-2感染或疾病的基于蛋白或mrna的疫苗的全身初次免疫施用如肌内、皮内或皮下施用，特别是肌内施用的受试者，和(d)已接受多于两次，特别是多于三次的针对sars-cov-2感染或疾病的基于蛋白或mrna的疫苗的全身施用如肌内、皮内或皮下施用，特别是肌内施用的受试者。
46、在一个具体的实施方案中，编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒用于引发针对sars-cov-2感染或疾病的长期保护性粘膜体液免疫应答和/或长期粘膜细胞免疫应答的初次免疫/加强免疫或靶向免疫方案，其中所述应答保护受试者的呼吸系统和/或cns。
47、在一个具体的实施方案中，编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒用于免疫方案，其中假型慢病毒载体颗粒引发针对sars-cov-2的cd8+t细胞应答。
48、在一个具体的实施方案中，编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒用于免疫方案，其中假型慢病毒载体颗粒引发对刺突特异性的肺驻留记忆cd8+t细胞(trm)和/或效应cd8+t细胞(tc1)并产生干扰素-gamma(ifn-gamma)/肿瘤坏死因子(tnf)/白介素-2(il-2)。在一个具体的实施方案中，根据本发明的用于用途的编码ars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒用于免疫方案，其中所述受试者从第一次注射针对sars-cov-2感染或疾病的疫苗组合物的初始疫苗接种后的第12周开始具有免疫减弱，所述疫苗组合物选自由针对sars-cov-2感染或疾病蛋白、mrna、腺病毒、灭活病毒和蛋白亚单位疫苗组合物组成的组，特别是针对sars-cov-2感染或疾病或sars-cov-2疾病恢复后，特别是covid-19恢复后的的基于蛋白或mrna的疫苗。
49、在小鼠的临床前结果中，发明人表明在最后一次施用表达刺突抗原的基于mrna的疫苗后4至5个月，不再有针对sars-cov-2的保护性免疫(vesin et al.,2022,mol ther30,2984-2997)。此外，现已充分证明，在最后一次施用表达刺突抗原的基于mrna的疫苗后的3至10个月，经疫苗接种的个体的血清中中和抗刺突抗体的水平显著降低(decru etal.,2022,front immunol.13,909910)。
50、还广泛证明的是，在免疫系统预暴露于抗原(包括sars-cov-2刺突)后，在疫苗接种的情况下-无论疫苗接种策略如何-或在感染的情况下，通常在b和t细胞区室中诱导记忆免疫(valyi-nagy et al.,2022,int j mol sci,23.10.3390)。就目前评估而言，在由疫苗接种或感染诱导的抗刺突免疫的情况下，预计这种记忆免疫平均持续至少一年(gallaiset al.,2021,ebiomedicine,71,103561)。这种记忆免疫是可加强的，至少直到最后一次施用mrna疫苗后一年。
51、在一个具体的实施方案中，在最后一次与sars-cov-2接触或施用针对sars-cov-2感染或疾病的疫苗组合物(选自由针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白、mrna、腺病毒、灭活病毒和蛋白亚单位疫苗组合物组成的组，特别是针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白或mrna疫苗组合物)之后，根据本发明的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒在根据本发明的受试者中作为鼻内粘膜加强或靶向免疫施用至少3个月，特别是3至24个月，优选3至12个月。
52、在一个具体的实施方案中，根据本发明的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒被配制成液体组合物或干粉，其用于作为鼻内气雾剂、鼻内滴剂或鼻内吹入剂施用。在一个具体的实施方案中，根据本发明的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒用于免疫方案，其中施用方案包括施用假型慢病毒载体颗粒的一种或多种剂型，其中每种剂型的剂量为107至109转导单位(tu)。
53、根据另一方面，本发明还涉及一种免疫原性组合物，其包含编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒和药学上可接受的载体，其中sars-cov-2的所述s蛋白的假型衍生物包含至少9个氨基酸突变，包括(i)seq id no:1的氨基酸序列的第417位赖氨酸残基突变为天冬酰胺残基(k417n)，(ii)seq id no:1的氨基酸序列的第484位谷氨酸残基突变为丙氨酸残基(e484a)，(iii)seq id no:1的氨基酸序列的第501位天冬酰胺残基突变为酪氨酸残基(n501y)，(iv)seq id no:1的氨基酸序列的第986位赖氨酸残基突变为脯氨酸残基(k986p)，(v)seq id no:1的氨基酸序列的第987位缬氨酸残基突变为脯氨酸残基(v987p)，(vi)seq id no:1的氨基酸序列的第446位甘氨酸残基突变为丝氨酸残基(g446s)，(vii)seq id no:1的氨基酸序列的第478位苏氨酸残基突变为赖氨酸残基(t478k)，(viii)seq id no:1的氨基酸序列的第493位谷氨酰胺残基突变为精氨酸残基(q493r)，和(ix)在seq id no:1的氨基酸序列的第498位谷氨酰胺残基突变为精氨酸残基(q498r)。
54、这种免疫原性组合物可以是假型慢病毒载体颗粒编码sars-cov-2的突变s蛋白，其氨基酸序列是seq id no:18。
55、根据另一个实施方案，所述免疫原性组合物可以是假型慢病毒载体颗粒编码sars-cov-2的突变s蛋白，其氨基酸序列是seq id no:24或seq id no:26。
56、根据另一个实施方案，免疫原性组合物被配制用于如本文实施方案所公开的鼻内施用。
57、本发明还涉及适用于实践本文公开的用途或方法的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括用于向受试者的上呼吸道施用根据本公开的编码sars-cov-2s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒的剂型，和应用器。在一些实施方案中，应用器是用于气溶胶吸入的应用器。在一些实施方案中，应用器是用于鼻滴注的应用器。在一些实施方案中，应用器是用于鼻吹入的应用器。每一个的合适实例在本领域中是已知的并且可以使用。
58、重组lv颗粒的制备是本领域已知的，包括获得非整合的、非复制的重组lv颗粒。特别参考ku mw,et al.cell host microbe,29(2),236-249e236,2021；ku mw et al,embomol med,e14459,2021,ku mw,charneau p,majlessi l.expert rev vaccines,1-16,2021所公开的。多核苷酸构建体可与编码所选刺突蛋白或其衍生物的序列相适应。
59、在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒包含hiv-1gag和pol蛋白。在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒包含亚型d，尤其是hiv-1ndk、gag和pol蛋白。
60、根据一些实施方案，慢病毒载体颗粒在用dna质粒转化的宿主细胞中获得。
61、这种dna质粒可以包含：
62、-细菌复制起点(例如：puc ori)；
63、-抗生素抗性基因(例如：ampir或kanr)用于选择；并且更特别地：
64、-慢病毒载体，其包含至少一种编码sars-cov-2s蛋白或其衍生物的核酸，所述核酸与启动子例如cmv启动子转录连接。
65、这种方法允许产生根据本发明的用于用途的重组载体颗粒，包括以下步骤：
66、i)用慢病毒载体转染合适的宿主细胞；
67、ii)用包装质粒载体转染所述宿主细胞，其包含至少编码逆转录病毒(优选慢病毒)的结构和聚合酶(+整合酶)活性的病毒dna序列；这种包装质粒在本领域有描述(dullet al.,1998,j virol,72(11):8463-71；zufferey et al.,1998,j virol 72(12):9873-80)；
68、iii)培养所述转染的宿主细胞以获得表达并将所述慢病毒载体包装为慢病毒载体颗粒；以及
69、iv)收获在所述培养的宿主细胞中由步骤iii)的表达和包装产生的慢病毒载体颗粒。
70、合适的宿主细胞优选为人培养细胞系，例如hek细胞系，如hek293t系。
71、或者，用于产生载体颗粒的方法在宿主细胞中进行，所述宿主细胞的基因组已用以下组分中的一种或多种稳定转化：慢病毒载体dna序列、包装基因和包膜基因。这种dna序列可被认为与根据本发明的前病毒载体相似，其包含额外的启动子以允许载体序列的转录并提高颗粒生产率。
72、在一个优选的实施方案中，宿主细胞被进一步修饰以能够在培养基中以连续方式产生病毒颗粒，而不使整个细胞膨胀或死亡。关于用于产生病毒颗粒的这种技术，可以参考strang et al.,2005,j virol79(3):1165-71；relander et al.,2005,mol ther 11(3):452-9；stewart etal.,2009,gene ther,16(6):805-14；和stuart et al.,2011,hum genether。
73、慢病毒颗粒载体可包含如前定义的以下元件：
74、-cppt/cts多核苷酸序列；以及
75、-编码在β2m或主要组织相容性复合体i型(mhc-i)启动子控制下的car的核酸，和任选地上述额外元件之一。
76、本发明的其它特征和优点将从下面的实施例中变得明显，并且也将在附图中示出。
技术实现思路
1.一种编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的刺突(s)蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其用作疫苗方案中的异源加强或靶向免疫剂，所述疫苗方案施用于受试者，特别是人受试者的上呼吸道，所述受试者接受了针对sars-cov-2感染或疾病的疫苗组合物的初次免疫，所述疫苗组合物选自由针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白、mrna、腺病毒、灭活病毒和蛋白亚单位疫苗组合物组成的组，特别是针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白或mrna疫苗组合物。
2.根据权利要求1所述的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其中所述施用是在受试者中作为鼻内粘膜加强或靶向免疫进行的，所述受试者接受了针对sars-cov-2感染或疾病的疫苗组合物的初次免疫，所述疫苗组合物选自由针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白、mrna、腺病毒、灭活病毒和蛋白亚单位疫苗组合物组成的组，特别是针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白或mrna疫苗组合物。
3.根据权利要求1或2所述的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其中：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其中所述s蛋白的氨基酸序列是seq id no:1或是具有与seq idno:1至少90％同一性的氨基酸序列的其衍生物，并且其中所述sars-cov-2的s蛋白的衍生物包含至少五个氨基酸突变，包括(i)seq id no:1的氨基酸序列的第417位赖氨酸残基突变为天冬酰胺残基(k417n)，(ii)seq id no:1的氨基酸序列的第484位谷氨酸残基突变为赖氨酸残基(e484k)或seq id no:1的氨基酸序列的第484位谷氨酸残基突变为丙氨酸残基(e484a)，(iii)seq id no:1的氨基酸序列的第501位天冬酰胺残基突变为酪氨酸残基(n501y)，(iv)seq id no:1的氨基酸序列的第986位赖氨酸残基突变为脯氨酸残基(k986p)，和(v)seq id no:1的氨基酸序列的第987位缬氨酸残基突变为脯氨酸残基(v987p)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其中接受了所述组合物施用的受试者选自(a)先前已接受针对sars-cov-2感染或疾病的疫苗组合物的受试者，所述疫苗组合物选自由针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白、mrna、腺病毒、灭活病毒和蛋白亚单位疫苗组合物组成的组，特别是作为全身初次免疫和/或加强免疫施用如肌内、皮内或皮下施用，特别是肌内初次免疫和/或加强免疫施用的针对sars-cov-2感染或疾病的基于蛋白或mrna的疫苗，(b)已接受针对sars-cov-2感染或疾病的疫苗组合物的全身初次免疫施用如肌内、皮内或皮下施用，特别是肌内初次免疫施用，且然后已从冠状病毒疾病如冠状病毒疾病2019(covid-19)恢复的受试者，所述疫苗组合物由针对sars-cov-2感染或疾病的蛋白、mrna、腺病毒、灭活病毒和蛋白亚单位疫苗组合物组成的组，特别是针对sars-cov-2感染或疾病的基于蛋白或mrna的疫苗组合物，(c)已首先从冠状病毒疾病如covid-19恢复，且然后已接受针对sars-cov-2感染或疾病的基于蛋白或mrna的疫苗的全身初次免疫施用如肌内、皮内或皮下施用，特别是肌内施用的受试者，和(d)已接受多于两次，特别是多于三次的针对sars-cov-2感染或疾病的基于蛋白或mrna的疫苗的全身施用如肌内、皮内或皮下施用，特别是肌内施用的受试者。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其中sars-cov-2的所述s蛋白还包含选自以下的氨基酸突变：(vi)seq id no:1的氨基酸序列的第446位甘氨酸残基突变为丝氨酸残基(g446s)，(vii)seq idno:1的氨基酸序列的第478位苏氨酸残基突变为赖氨酸残基(t478k)，(viii)seq id no:1的氨基酸序列的第493位谷氨酰胺残基突变为精氨酸残基(q493r)，和(ix)seq id no:1的氨基酸序列的第498位谷氨酰胺残基突变为精氨酸残基(q498r)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其中sars-cov-2的经编码的突变s蛋白具有seq id no:10或seqid no:18，优选seq id no:10的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其中所述假型慢病毒载体颗粒用水泡性口炎病毒糖蛋白g(vsv-g)蛋白假型化。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其用于引发针对sars-cov-2感染或疾病的长期保护性粘膜体液免疫应答和/或长期粘膜细胞免疫应答的初次免疫/加强免疫或靶向免疫方案中，其中所述应答保护受试者的呼吸系统和/或中枢神经系统。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其中所述假型慢病毒载体颗粒引发针对sars-cov-2的cd8+t细胞应答。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其中所述假型慢病毒载体颗粒引发对刺突特异性的肺驻留记忆cd8+t细胞(trm)和/或效应cd8+t细胞(tc1)并产生干扰素-gamma(ifn-γ)/肿瘤坏死因子(tnf)/白介素-2(il-2)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其中所述假型慢病毒载体颗粒是非整合的、非致细胞病变的和非复制的。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其中所述受试者从第一次注射针对sars-cov-2感染或疾病的疫苗组合物的初始疫苗接种后的第12周开始具有免疫减弱，所述疫苗组合物选自由针对sars-cov-2感染或疾病蛋白、mrna、腺病毒、灭活病毒和蛋白亚单位疫苗组合物组成的组，特别是针对sars-cov-2感染或疾病或sars-cov-2疾病恢复后，特别是covid-19恢复后的的基于蛋白或mrna的疫苗。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其中所述假型慢病毒载体颗粒被配制成液体组合物或干粉，其用于作为鼻内气雾剂、鼻内滴剂或鼻内吹入剂施用。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的用于用途的编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒，其中所述施用方案包括施用所述假型慢病毒载体颗粒的一种或多种剂型，其中每种剂型的剂量为107至109转导单位(tu)。
16.一种免疫原性组合物，其包含编码sars-cov-2的s蛋白或其衍生物的假型慢病毒载体颗粒和药学上可接受的载体，其中sars-cov-2的所述s蛋白的假型衍生物包含至少9个氨基酸突变，包括(i)seq id no:1的氨基酸序列的第417位赖氨酸残基突变为天冬酰胺残基(k417n)，(ii)seq id no:1的氨基酸序列的第484位谷氨酸残基突变为丙氨酸残基(e484a)，(iii)seq id no:1的氨基酸序列的第501位天冬酰胺残基突变为酪氨酸残基(n501y)，(iv)seq id no:1的氨基酸序列的第986位赖氨酸残基突变为脯氨酸残基(k986p)，(v)seq id no:1的氨基酸序列的第987位缬氨酸残基突变为脯氨酸残基(v987p)，(vi)seq id no:1的氨基酸序列的第446位甘氨酸残基突变为丝氨酸残基(g446s)，(vii)seq id no:1的氨基酸序列的第478位苏氨酸残基突变为赖氨酸残基(t478k)，(viii)seqid no:1的氨基酸序列的第493位谷氨酰胺残基突变为精氨酸残基(q493r)，和(ix)在seqid no:1的氨基酸序列的第498位谷氨酰胺残基突变为精氨酸残基(q498r)。
17.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中sars-cov-2的经编码的突变s蛋白具有seq id no:18的氨基酸序列。
18.根据权利要求16或17所述的免疫原性组合物，其被配制用于鼻内施用。
