本发明涉及基因工程，尤其涉及一种基于ms087蛋白的滑液囊支原体elisa抗体检测方法。
背景技术：
1、滑液囊支原体病是由滑液囊支原体(mycoplasma synoviae，ms)感染引起的一种家禽的传染病，主要感染鸡和火鸡。该病在全世界广泛流行，主要引起肉鸡的气囊炎、滑膜炎和关节炎；以及会造成肉鸡的产蛋下降和产eaa鸡蛋(蛋壳尖端异常，eggshell apexabnormalities)。
2、目前防控滑液囊支原体病最有效的方法是采取良好的生物安全措施，特别是阻断滑液囊支原体进入鸡群和对已感染滑液囊支原体的鸡群进行净化，上述工作首先需要建立特异性高、灵敏性好的滑液囊支原体检测方法。
3、目前应用最广泛的用于检测滑液囊支原体抗体的检测方法是elisa方法。在我国上市的滑液囊支原体elisa抗体检测试剂盒是美国idexx公司开发试剂盒，该试剂盒所用的包被抗原为滑液囊支原体全菌。滑液囊支原体和其他禽类支原体，如鸡毒支原体存在共同的抗原表位。鸡毒支原体也是鸡场常见的病原菌，也能刺激机体产生抗体。使用idexx公司的滑液囊支原体elisa抗体检测试剂盒检出的抗体可能是鸡毒支原体抗体，也就是该试剂盒的特异性不高。因此，需要开发特异性好的滑液囊支原体elisa抗体检测方法。
4、本技术人在发生滑液囊支原体病的肉鸡的关节分离到一株滑液囊支原体，命名为cqtl01株。经测序发现该菌的一个基因在滑液囊支原体菌株中既有基因本身的保守性，又有基因序列的保守性，我们将之命名为ms087基因，编码的蛋白为ms087蛋白。经生物信息学预测，该蛋白可能是一种分泌蛋白。基于此，我们拟以ms087蛋白作为包被抗原，建立一种高特异性和灵敏性的滑液囊支原体elisa抗体检测方法。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种基于ms087蛋白作为包被抗原的高特异性和灵敏性的滑液囊支原体elisa抗体检测方法。
2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
3、ms087基因在滑液囊支原体抗体检测上的应用，所述ms087基因的核苷酸序列如seq id no.1所示或者具有如seq id no.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。
4、ms087基因表达的ms087蛋白在滑液囊支原体抗体检测上的应用，所述ms087蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示或具有如seq id no.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。
5、一种利用ms087蛋白进行滑液囊支原体elisa抗体检测的方法，包括以下步骤：
6、根据滑液囊支原体cqtl01菌株基因组合成ms087基因，所述ms087基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；
7、pcr扩增所述ms087基因；
8、提取pet-30a(+)载体质粒；
9、构建pet-30a(+)-ms087重组质粒；
10、pet-30a(+)-ms087重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，得到重组菌大肠杆菌bl21(de3)-pet-30a(+)-ms087；大肠杆菌bl21(de3)-pet-30a(+)-ms087经iptg诱导后，表达ms087重组蛋白；
11、纯化ms087重组蛋白；透析ms087重组蛋白；浓缩ms087重组蛋白；
12、以ms087蛋白为包被抗原，建立检测液囊支原体抗体的elisa方法。
13、进一步地，其中，pcr扩增所述ms087基因，包括：
14、以滑液囊支原体cqtl01菌株基因组为模板，使用引物扩增ms087基因；
15、所述引物包括上游引物ms087-f和下游引物ms087-r；
16、所述上游引物和下游引物分别引入bamhⅰ和xhoⅰ酶切位点和相应保护性碱基，引物序列为：
17、ms087-f：5′-cgcggatccatgaaaataaaaaaacttttatcttttgc-3′
18、ms087-r：5′-ccgctcgagatcatttgcaaaattagttaaataagt-3′。
19、进一步地，其中，pcr扩增所述ms087基因，还包括：
20、对pcr产物进行胶回收，包括以下步骤：
21、(1)配制1.5％琼脂糖凝胶；
22、(2)将pcr扩增产物加入凝胶上样孔，120v电泳至合适位置；
23、(3)在蓝光切胶仪中，切下含目的片段的凝胶，放入提前称重的1.5ml灭菌离心管称取总重量；
24、(4)向放有胶块的离心管中加入300μl buffer mb；
25、(5)37℃溶解凝胶，溶解期间每隔2min将离心管取出颠倒混匀，直到胶块完全溶解；
26、(6)将完全溶解的凝胶溶液转移至吸附柱中，室温静置1min，12000r/min离心1min，弃收集管中的滤液；
27、(7)向吸附柱中加入750μl的buffer wb，12000r/min室温离心1min，弃滤液；
28、(8)重复步骤(7)一次；
29、(9)将吸附柱放于新的收集管中，12000r/min室温离心2min，弃滤液；
30、(10)将吸附柱放于新的1.5ml灭菌离心管，在吸附柱膜的中心加入50μlddh2o，室温静置2min；
31、(11)室温12000r/min离心2min，洗脱dna。
32、进一步地，提取pet-30a(+)载体质粒，包括：
33、(1)取-80℃保存的大肠杆菌bl21(de3)-pet-30a(+)，划线接种于kan+lb平板，37℃过夜培养；
34、(2)挑取kan+lb平板上的单菌落，接种于10ml kan+lb液体培养基，37℃培养8h；
35、(3)取2ml培养菌液，室温13000r/min离心1min，弃上清，收集菌体；
36、(4)加入250μl buffer p1/rnasea混合液，重悬菌体；
37、(5)向重悬液中加入250μl buffer p2，上下颠倒混匀10次；
38、(6)加入350μl buffer p3，上下颠倒混匀10次；
39、(7)13000r/min离心10min；
40、(8)将吸附柱装在收集管中，离心后的上清液转移至吸附柱中，13000r/min离心60s；
41、(9)弃滤液，把吸附柱放回收集管，加入500μl buffer pw1至吸附柱中，13000r/min离心60s；
42、(10)弃滤液，把吸附柱放回收集管，加入600μl用无水乙醇稀释的buffer pw2至吸附柱中，13000r/min离心60s；
43、(11)弃滤液，把吸附柱放回收集管，13000r/min离心1min；
44、(12)取出吸附柱放于1.5ml灭菌离心管，加入50μl ddh2o到吸附柱膜中心，室温静置1min，13000r/min离心1min洗脱dna；
45、(13)弃吸附柱，将提取的质粒放于-20℃保存。
46、进一步地，构建pet-30a(+)-ms087重组质粒，包括：
47、将pcr扩增后胶回收的产物与pet-30a(+)载体质粒分别用bamhⅰ和xhoⅰ进行双酶切；
48、酶切后取酶切产物，琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果；酶切产物用dna凝胶回收试剂盒回收；
49、根据外源片段与载体物质的量之比为3:1的原则进行连接反应，并进行连接产物转化与阳性重组子的筛选鉴定：
50、(1)取两管大肠杆菌dh5α感受态，将10μl连接产物全部加入一管大肠杆菌dh5α感受态中，吹打混匀，另一管大肠杆菌dh5α感受态不加外源dna片段，瞬时离心，冰水浴1h；
51、(2)42℃热休克90s，立即冰水浴2min，加入600μl lb液体培养基，37℃220r/min培养1h；
52、(3)培养的菌液5000r/min离心5min，弃550μl上清，剩余上清和沉淀吹打混匀，吸取100μl涂布到kan+lb平板，37℃培养18-24h；
53、(4)挑取kan+lb平板上的单菌落接种10mlkan+lb液体培养基，37℃220r/min培养10-12h；
54、(5)提取质粒，提取的重组质粒用bamh i和xhoi进行双酶切鉴定；
55、反应体系震荡混匀，瞬时离心，37℃反应1h；反应结束后，取5μl酶切产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
56、进一步地，以ms087蛋白为包被抗原，检测液囊支原体抗体，其反应条件为：
57、(1)用0.05mol/l碳酸盐缓冲液调整纯化的ms087蛋白浓度为2μg/ml，每孔加入100μl，37℃孵育1h后4℃过夜，pbst洗涤5次，每次3min；
58、(2)每孔加入200μl 1％bsa，37℃封闭3h，pbst洗涤5次，每次3min；
59、(3)鸡血清用1％bsa按1:500比例稀释后，每孔加入100μl，37℃孵育1.5h，pbst洗涤5次，每次3min；
60、(4)hrp标记山羊抗鸡igg用1％bsa按1:20000比例稀释后，每孔加入100μl，37℃孵育2h，pbst洗涤5次，每次3min；
61、(5)每孔加入底物液a、b各50μl，混匀，室温避光显色5min后加入50μl终止液，10min内酶标仪测定并记录od450nm。
62、本发明至少具备以下有益效果：
63、本发明ms087蛋白作为包被抗原，建立一种高特异性和灵敏性的滑液囊支原体elisa抗体检测方法：
64、批内重复性试验的变异系数在1.32％-5.81％之间，小于6％。表明同一批次包被的酶标板批间变异系数较小，具有良好的批内重复性；
65、批间重复性试验的变异系数在4.48％-8.77％，小于10％。表明不同批次制备的试剂盒批间变异系数小，具有良好的批间重复性；
66、建立的基于ms087蛋白的滑液囊支原体elisa抗体检测方法具有良好的特异性；
67、建立的间接elisa方法的灵敏性高：该方法阳性血清最高可稀释1000倍。
1.ms087基因在滑液囊支原体抗体检测上的应用，其特征在于，所述ms087基因的核苷酸序列如seq id no.1所示或者具有如seq id no.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。
2.ms087基因表达的ms087蛋白在滑液囊支原体抗体检测上的应用，其特征在于，所述ms087蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示或具有如seq id no.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。
3.一种利用ms087蛋白进行滑液囊支原体elisa抗体检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，pcr扩增所述ms087基因，包括：
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，pcr扩增所述ms087基因，还包括：
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，提取pet-30a(+)载体质粒，包括：
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，其中，构建pet-30a(+)-ms087重组质粒，包括：
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以ms087蛋白为包被抗原，检测液囊支原体抗体，其反应条件为：
