本发明涉及生物，具体涉及一种基于真菌生物发光途径的蛋白质-dna互作检测系统和检测方法。
背景技术：
1、蛋白质和dna是构成生物体最重要的两类生物大分子，两者特异性识别及相互作用对生物体的生命活动如dna复制、修复、转录等至关重要。dna与蛋白质的相互作用可以从dna、蛋白质、dna-蛋白质复合物三个层次上来研究。在dna水平上，可以研究dna构象及与蛋白质相结合的确切碱基序列；在蛋白质水平上，可以根据结合特定的dna序列进而确定结合蛋白的种类；在dna-蛋白质复合物水平上，由于氨基酸与dna之间有着紧密的联系，可以对dna表面的蛋白进行识别；此外，也可对蛋白质的三级结构以及在复合物中的构象变化进行研究。最后，可对dna-蛋白复合物的整体特性(如形成动力学、亲和力、形成或解离动力学、稳定性等)有清楚的认识。
2、目前，用于研究蛋白质与dna互作(protein-dna interaction，dpi)的技术较多，具有代表性的包括酵母单杂交系统(yeast one-hybrid,y1h)、染色质免疫共沉淀技术(chromatinimmunoprecipitation assay,chip)、电泳迁移率变动实验(electrophoreticmobility ahift assay,emsa)、双荧光素酶报告基因检测实验(dual-luciferasereporter assay,dlr)等。上述技术对于dna-蛋白质相互作用研究的侧重点不同，尽管它们在该领域的研究已取得一定科研成果，但仍有其缺陷与局限性。
3、其中，双荧光素酶报告基因检测系统是在细胞中同时表达萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，检测原理是利用荧光素酶与底物发生化学发光反应的特点，将目的基因转录调控元件克隆到萤火虫荧光素酶基因的上游，构建荧光素酶报告质粒，然后将报告基因质粒转染细胞，经不同处理后裂解细胞，加入底物荧光素，测定荧光素酶活性，通过荧光素酶活性的高低判断不同处理对目的基因转录调控元件的影响。为避免由于质粒转染细胞时效率差异所造成的误差，引入海肾荧光素酶作为内参，即双荧光报告系统。萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶因其具有强信号且不需要外加激发光，常作为分子成像的探针，但该技术依赖于外加昂贵的荧光素底物，发光信号不持久且不稳定，这可能会阻碍生物学的研究(strack2019)。
4、2018年，kotlobay等人完成了光茸菌neonothopanus nambi中的真菌荧光素酶和其他三种关键酶的鉴定，成功解析出了真菌生物发光途径(kotlobay等2018)。牛奶树碱合酶(hispidin synthase,hisps)、牛奶树碱-3-羟化酶(hispidin-3-hydroxylase,h3h)、真菌荧光素酶(luciferase,luz)和咖啡酰丙酮酸水解酶(caffeylpyruvate hydrolase,cph)，它们共同形成了从咖啡酸到真菌荧光素的生物合成循环。2020年，两个课题组先后证实了用真菌发光途径培育自发光植物的可行性(khakhar等2020；mitiouchkina等2020)。其中一个课题组将构巢曲霉(aspergillus nidulans)基因组中的npga(4’-phosphopantetheinyl transferase)基因和光茸菌(neonothopanus nambi)基因组中的h3h基因、hisps基因、luz基因进行密码子优化，转入烟草核基因组中，转基因植株发出裸眼可见光，且亮度相比利用细菌生物发光系统得到的植物提升至少一个数量级(shakhova等2024)。我们前期的研究发现该发光底物咖啡酸在植物中普遍存在(zheng等2023)，在另外两个实验室研究中发现在动物细胞中引入微生物来源的基因tal，hpab，hpac和上述发光途径核心基因hisps，h3h，luz，cph可以实现动物细胞的发光(mitiouchkina等2020；shakhova等2024)，表明该发光系统在动植物受体细胞中有广泛应用。这些研究为开发基于内源底物，并适用于动植物细胞的蛋白质-dna相互作用报告系统奠定了基础。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种检测灵敏度高、操作方便简单、成本低廉的检测工具，将其应用到蛋白质-dna相互作用的检测当中。
2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、本发明提供了一种基于真菌生物发光途径(fungal bioluminescence pathway，fbp)开发的蛋白质-dna互作检测方法，包括以下步骤：
4、(1)利用多基因组装技术将hisps基因、cph基因、h3h基因、npga基因整合到受体载体中，构建获得多基因载体；
5、(2)将待验证的目标蛋白质编码基因片段克隆到表达载体中构建目的蛋白表达载体；将待验证的目的dna片段克隆到报告基因表达载体中luz基因的上游，构建目的dna-luz载体；
6、(3)利用瞬时转化技术将三个表达载体共同转化到受体中表达，观察受体的发光情况，与仅转化多基因载体和目的dna-luz载体的对照组相比，若发光强度显著增强或减弱，则判断目标蛋白质与目的dna互作；若发光强度无显著变化，则判断目标蛋白质与目的dna不互作。
7、所述受体可以为但不限于植物或动物细胞系。所述目的蛋白质可以为但不限于转录调控因子。所述目的dna可以为但不限于启动子。
8、所述hisps基因、h3h基因、npga基因、luz基因、cph基因编码的蛋白酶参与咖啡酸循环。具体的，hisps将咖啡酸转化为牛奶树碱，牛奶树碱在h3h的羟基化下产生3-羟基牛奶树碱，即真菌荧光素(fungal luciferin)。真菌荧光素酶luz在有氧的情况下将真菌荧光素转化为内过氧化物作为不稳定的高能中间体，该中间体能释放出520nm的绿光并产生咖啡酰丙酮酸，cph可将其转化为咖啡酸，从而实现咖啡酸的循环再生。
9、本发明提供的检测方法中构建了三个表达载体，将上述真菌生物发光通路中的5个关键酶编码基因分别构建到其中两个表达载体中，多基因载体中具有用于表达hisps、cph、h3h、npga的表达模块，转化到受体植物或动物细胞中表达并利用动植物内源咖啡酸为原料转化生成真菌荧光素；目的dna-luz载体中具有用于表达luz的表达模块，其中luz编码基因上游整合待验证的目标dna。第三个表达载体用于表达待验证的目标蛋白质，当表达的目标蛋白质与目标dna发生互作，对下游报告基因luz的转录表达起到促进或抑制作用，影响真菌荧光素酶的生成，进而影响对底物真菌荧光素的催化反应，表现为荧光强度的增强或减弱；如果待验证目标蛋白质不与目的dna互作，则不表现荧光强度的变化。
10、咖啡酸是动植物中一种广泛存在的苯丙酸代谢产物，与常用的萤火虫荧光素酶系统相比，咖啡酸代谢清晰，可以由动植物细胞代谢产生，且对动植物细胞毒性弱，稳定性高且易被吸收。研究指出真菌荧光素酶具有稳定性与细胞渗透性，且其发光信号与萤火虫荧光素酶相当(strack 2019)。
11、本发明中，根据受体的特性选择合适的表达质粒进行重组载体构建。
12、作为本发明的一种具体实施方式，针对受体为植物，所述多基因载体中各目的基因的上游均含有35s启动子序列；所述目的蛋白表达载体中目标蛋白质编码基因的上游含有35s启动子序列。具体的，所述35s启动子为camv 35s启动子。
13、作为优选，步骤(1)中，采用transgene stacking ii系统进行多基因组装。所述transgene stacking ii系统为多基因组装载体系统，参见申请号为2017103841977的中国专利。具体的，以pyl322d1作为供体载体ⅰ，pyl322d2作为供体载体ⅱ，pyltac380gw作为受体载体。
14、作为优选，步骤(2)中，所述目的蛋白表达载体的原始载体为pcambia1300载体。利用生物学技术手段将待验证的目标蛋白编码基因插入到pcambia1300载体的多克隆位点中。
15、作为优选，步骤(2)中，所述目的dna-luz载体在pgreenⅱ0800-luc载体基础上进行改造，其构建方法包括：利用生物学技术手段首先将pgreenⅱ0800-luc载体中的luc基因替换为luz基因，然后在luz基因上游多克隆位点插入待验证的目的dna片段。
16、作为优选，利用同源重组技术构建目的蛋白表达载体和目的dna-luz载体。
17、本发明中，根据受体的密码子偏好性对各基因编码序列进行密码子优化。当受体为烟草时，作为优选，所述hisps基因的编码序列如seq id no.1所示，所述cph基因的编码序列如seq id no.2所示，所述h3h基因的编码序列如seq id no.3所示，所述npga基因的编码序列如seq id no.4所示。所述luz基因编码序列如seq id no.5所示。
18、作为优选，步骤(3)中，利用农杆菌介导的瞬时转化技术将三个表达载体共同转化到受体中。具体的，所述瞬时转化技术包括：将三个表达载体分别转化至农杆菌细胞中，等比例混合于侵染液中，然后侵染受体进行瞬时表达。
19、作为优选，多基因载体和蛋白表达载体转化到农杆菌gv3101中，目的dna-luz载体转化到农杆菌gv3101(psoup)中。
20、作为优选，所述侵染液的组成包括：10mm mgcl2，10mm mes，150μm as。
21、作为优选，受体植物侵染的部分为叶片。
22、作为优选，受体植物为烟草。本发明适用的受体植物并不局限于烟草。
23、侵染完成后，室温下培养72h后使用成像系统进行荧光成像并计算光量子。
24、本发明的另一个目的是提供一种基于真菌发光途径的蛋白质与dna互作的检测系统，所述系统包括表达质粒体系、农杆菌介导的瞬时表达体系和荧光成像系统，所述表达质粒体系包括：
25、用于合成真菌荧光素的多基因载体，包含用于表达h3h、hisps、cph、npga的表达模块；
26、用于表达目标蛋白的蛋白表达载体，其多克隆位点用于插入待验证的目标蛋白编码基因；
27、含有真菌荧光素酶表达模块的报告基因表达载体，表达模块中luz基因上游多克隆位点用于插入待验证的目的dna片段；
28、所述农杆菌介导的瞬时表达体系包括农杆菌和受体。
29、所述荧光成像系统可以采用但不限于植物活体成像系统、ccd相机。
30、作为本发明的一种具体实施方式，受体采用植物组织。
31、作为优选，所述多基因载体采用transgene stacking ii系统进行多基因组装构建。
32、作为优选，所述蛋白表达载体的原始载体采用pcambia1300载体。
33、作为优选，所述报告基因表达载体为pgreenⅱ0800-luc载体上的luc基因替换为luz基因构建得到。
34、作为优选，受体植物采用烟草叶片。
35、作为本发明的具体应用，所述目标蛋白-目的dna组合可以为但不限于与调控水稻种子活力相关的bzip42-pper1a、与调节氮利用能力相关的dreb1c-prbcs3以及与调控水稻抗病毒免疫相关的jamyb-pago18。
36、本发明具备的有益效果：
37、本发明首次利用真菌生物发光途径开发用于检测蛋白质-dna相互作用的系统以及检测方法，方便简单，灵敏度高，成本低廉，无需添加底物，使用普通ccd相机曝光1-3min即可检测荧光值。本发明为研究蛋白质-dna相互作用提供了一种新的可行方案。
1.一种基于真菌生物发光途径的蛋白质-dna互作检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的基于真菌生物发光途径的蛋白质-dna互作检测方法，其特征在于，所述多基因载体中各目的基因的上游均含有35s启动子序列；所述目的蛋白表达载体中目标蛋白质编码基因的上游含有35s启动子序列。
3.如权利要求1所述的基于真菌生物发光途径的蛋白质-dna互作检测方法，其特征在于，步骤(1)中，采用transgene stacking ii系统进行多基因组装。
4.如权利要求1所述的基于真菌生物发光途径的蛋白质-dna互作检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述目的蛋白表达载体的原始载体为pcambia1300载体。
5.如权利要求1所述的基于真菌生物发光途径的蛋白质-dna互作检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述目的dna-luz载体的构建方法包括：利用生物学技术手段首先将pgreenⅱ0800-luc载体中的luc基因替换为luz基因，然后在luz基因上游多克隆位点插入待验证的目的dna片段。
6.如权利要求1所述的基于真菌生物发光途径的蛋白质-dna互作检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述瞬时转化技术包括：将三个表达载体分别转化至农杆菌细胞中，等比例混合于侵染液中，然后侵染受体进行瞬时表达。
7.如权利要求6所述的基于真菌生物发光途径的蛋白质-dna互作检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述受体为植物叶片。
8.如权利要求6或7所述的基于真菌生物发光途径的蛋白质-dna互作检测方法，其特征在于，所述受体为烟草；所述hisps基因的编码序列如seq id no.1所示，所述cph基因的编码序列如seq id no.2所示，所述h3h基因的编码序列如seq id no.3所示，所述npga基因的编码序列如seq id no.4所示，所述luz基因编码序列如seq id no.5所示。
9.一种基于真菌发光途径的蛋白质与dna互作的检测系统，其特征在于，所述系统包括表达质粒体系、农杆菌介导的瞬时表达体系和荧光成像系统，所述表达质粒体系包括：
10.如权利要求9所述的检测系统，其特征在于，所述多基因载体采用transgenestacking ii系统进行多基因组装构建；所述蛋白表达载体的原始载体采用pcambia1300载体；所述报告基因表达载体为pgreenⅱ0800-luc载体上的luc基因替换为luz基因构建得到。
