本发明涉及分子生物学、蛋白组学及高端医疗器械领域，尤其是放射防护领域，具体涉及到了一种供氢体修饰的sod制备方法及在放疗防护领域的应用。
背景技术：
1、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,s0d)是目前发现的生物体内唯一的一类超氧阴离子清除剂，使超氧阴离子歧化生成h2o2和o2，h2o2在过氧化氢酶或者谷胱苷肽酶的作用下生成h2o和o2，sod因此在阻止和清除自由基连锁反应中发挥着重要作用，成为广泛研究的焦点。然而，sod在体内应用面临多种挑战，包括：1.体内半衰期短(6-10分钟)：sod在体内快速降解，限制了其长时间发挥作用的能力；2.稳定性差：在体内环境中易于失活，影响其疗效；3.难以进入细胞内：sod分子较大，难以通过细胞膜，限制了其在细胞内的抗氧化作用；
2、4.与细胞膜亲和力小：sod无法有效附着于细胞膜，降低了其清除自由基的效率；5.抗原性：外源性sod可能引发免疫反应，导致副作用。
3、为了克服上述问题，现有技术主要采用化学修饰的方法对sod进行改造，但这些方法存在复杂且效率低下的问题。具体包括：
4、1.专利cn101768582a：该专利公开了一种月桂酰修饰sod的生产工艺，使用大量多种化学原料，工艺步骤复杂，且sod的活性在过程中存在大量损失。
5、2.专利cn100360666c：该专利公布了一种以高分子材料聚乙二醇(peg)为主要修饰剂、氰脲酰氯为活化剂的玉米sod修饰方法，需要使用乙醚、氰脲酰氯和四硼酸钠等具有生物毒性的物质进行系列的修饰反应，这些物质的残留对sod的应用具有一定的限制。
6、3.专利cn104152421a：该专利采用氯化亚砜对月桂酸进行活化后，再进行sod修饰，过程需要使用高温且实验过程中易产生有毒气体等，活化工艺存在安全隐患等因素以及无法放大生产等缺陷。
7、除此之外，目前相关研究仅聚焦于动物源sod的修饰，对于重组表达的sod修饰基本空白，且目前的研究主要着重于对sod的稳定性、抗原性等，而对sod的活性及自由基代谢途径研究较少，尤其是在增加sod稳定性的同时增加sod对h202的干扰及对羟基自由基的清除效果方面鲜有研究。
技术实现思路
1、为了克服这些缺点，本发明提出了一种供氢体修饰的sod制备方法，通过简化工艺步骤、提高sod的活性和稳定性，提供了一种更为高效、稳定和安全的sod修饰方法，这不仅拓宽了sod在放射防护领域的应用前景，也为其在其他领域的应用提供了新的可能性。
2、为了解决上述问题，为此本发明提供了一种以供氢体作为修饰剂对sod采用酶法进行修饰，制备方法简单，且可以将纯化和修饰一次性在层析柱上同步解决，同时在sod的16q、153q引入具有供氢体作用的壳聚寡糖，使修饰后的sod活性、稳定性、亲和性都有一定的提高，同时供氢体修饰的sod除了具备清除超氧阴离子自由基的作用，同时在反应体系中提供额外的电子用于中和羟基自由基等其他衍生的自由基。
3、进一步地，所述的供氢体修饰的sod为植物提取、动物血液提取的cu/zn-sod或人源重组表达的cu/zn-sod，其中优选人源重组表达的cu/zn-sod。
4、进一步地，所述的人源重组表达的cu/zn-sod氨基酸序列由genbank中公布的人源cu/zn-sod的氨基酸序列aar21563.1，经swiss-model及swiss-pdbviewer 4.1.0软件建模，对其氨基酸序列、蛋白空间结构及活性中心进行预测后，对氨基酸序列进行以下突变c7a、e25g、p29t、e101v，c112s形成的sod*氨基酸序列pro-seq1；
5、更进一步地，所述的sod*氨基酸根据原核表达系统大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化获得突变型的sod编码基因序列dna-seq 1；将dna-seq 1序列经合成后定向插入定向插于pet28a载体的nde i与xho i之间，形成pet-28a-sod*质粒，转入大肠杆菌bl21(de3)，经验证后进行发酵培养，低温诱导表达。
6、更进一步地，人源重组表达的cu/zn-sod氨基酸序列(aar21563.1)为：
7、更进一步地，所述sod*氨基酸序列pro-seq1为：
8、
9、更进一步地，所述突变型的sod编码基因序列dna-seq 1为：
10、
11、进一步地，所述的供氢体修饰方案可以对sod蛋白的氨基酸残基进行缩合反应修饰、酰胺化反应修饰、转氨化反应、酶法修饰等修饰方式中的一种或多种组合，其中优选酶法修饰。所述的酶法修饰，采用谷氨酰胺转氨酶，使用浓度为0.1％～5％。
12、进一步地，所述的供氢体对sod的修饰主要修饰位点为赖氨酸残基、谷氨酰胺残基，其中优选修饰位点为谷氨酰胺残基，如16q、23q、154q，
13、作为优选地，谷氨酰胺残基暴露于蛋白质外部的16q、154q位点。
14、进一步地，所述供氢体通式为r-nh2，其中r为多元醇或者多糖结构，主要由氨基甘露糖、氨基葡聚糖、壳聚寡糖、聚乙二醇氨等中的一种或多种组成，其中优选壳聚寡糖、氨基葡聚糖的中的任意一种。r1-nh2由甘露醇、氨基甘露糖、壳聚寡糖、氨基葡聚糖等中的一种或多种组成，其中优选壳聚寡糖、氨基葡聚糖中的任意一种，工作浓度为0.1％-0.5％。
15、进一步地，所述的供氢体修饰sod的修饰及纯化方法，采用柱上修饰-纯化工艺。所述的柱上修饰-纯化方法采用亲和层析方式，亲和填料采用螯合铜离子的cheating-sepharose；
16、更进一步地，所述柱上修饰-纯化方法包括以下步骤：
17、s1、装柱：将20％乙醇保护的cheating-sepharose，装载于夹套式层析柱，自然沉降并以启动蠕动泵恒速进行压柱，至柱体积不在变化为准，计算柱体积，调整夹套冷却水温度为4℃；
18、s2、负载铜离子：用10倍柱体积的超纯水清洗，至流出液无乙醇；用50mm硫酸铜溶液，循环上柱，至层析柱由白色完全转为蓝色为止，并用ph6.6，0.015mol磷酸钾盐缓冲液洗涤2-5柱体积，以洗脱未结合的铜离子；
19、s3-1、样品制备1，sod冻干粉样品：取sod冻干粉加入ph6.6，0.015mol磷酸钾盐缓冲液，制备成10-20mg/ml的sod溶液；
20、s3-2样品制备2，重组人源sod样品：取诱导表达后的大肠杆菌发酵液，经3000rpm离心5分钟，取沉淀物。经无菌生理盐水多次洗涤后，用ph6.6，0.015mol磷酸钾盐缓冲液重悬，并利用细胞破碎机进行细胞裂解，10000rpm离心5分钟，取上清液即为样品溶液；
21、s4、样品上样：调整夹套冷却水温度为40℃，sod溶液样品以0.01-0.1倍柱体积/分钟的流速进行循环上样，至a280吸光度平衡为准。以5倍柱体积的ph6.6，0.015mol磷酸钾盐缓冲液，洗脱未结合的sod；
22、s5、柱上修饰：配制ph6.6，0.015mol磷酸钾盐缓冲液，加入谷氨酰胺转氨酶使其浓度0.1-0.5％，加入权利要求6所述的供氢体壳聚寡糖或氨基葡聚糖使其浓度为0.1％-0.5％。上述溶液以0.01-0.1倍柱体积/分钟的流速进行循环上样，1-3小时；
23、s6、纯化洗脱1：调整夹套冷却水温度为4℃，ph6.6，0.015mol磷酸钾盐缓冲液洗涤1-2柱体积，以去除柱上未结合的供氢体及谷氨酰胺转氨酶；
24、s7、纯化洗脱2：采用0.1mol/l，ph5.0的柠檬酸缓冲液，对修饰后的sod进行洗脱并收集洗脱液；
25、s8、脱盐：上述洗脱液采用葡聚糖凝胶g50层析柱进行脱盐，以纯化水进行洗脱，利用紫外检测器检测a280数据，当a280数据增加时开始收集、至a280数据回落，并测定洗脱液的体积和蛋白含量、活性，并计算蛋白总量；
26、s9、按照冻干保护剂10:1-100：1的比例，加入混合冻干保护剂(海藻糖：甘露醇为9:1)，进行冻干，即为供氢体修饰sod的冻干粉。
27、进一步地，所述供氢体修饰的sod的在放疗防护方面特别是皮肤防护方面应用，供氢体修饰的sod配合修复液使用，所述的修复液由10-50mm磷酸盐缓冲液，ph5.5±0.5、1-5％甘油或山梨醇、0.01％-0.05％vb12、0.05-0.2％山梨酸钾等组成。
28、进一步地，所述供氢体修饰的sod的在放疗防护方面特别是皮肤防护方面应用，，供氢体修饰的sod配合修复液使用，所述的修复液由10-50mm磷酸盐缓冲液(ph7.0-7.2)、1-5％甘油或山梨醇、15-25％泊洛沙姆、0.01％-0.05％vb12、0.05-0.2％山梨酸钾等组成。
29、本发明相对于现有技术所取得的有益的技术效果如下：
30、1.提高sod的稳定性和半衰期：通过供氢体的修饰，本发明大幅度提升了sod在体内的稳定性和半衰期。与传统的sod修饰方法相比，本发明使用了供氢体修饰，可以显著延长sod在体内的作用时间，提高其在放疗防护中的效果。
31、2.增强sod的活性和亲和力：通过引入壳聚寡糖等供氢体，本发明不仅提高了sod的稳定性，还增强了其对自由基的清除能力。供氢体提供额外的电子，可以中和更多的自由基，提高了sod的整体抗氧化性能。同时，修饰后的sod与细胞膜的亲和力也得到了增强，有利于其更有效地发挥作用。
32、3.简化生产工艺：本发明采用柱上修饰-纯化一体式的方法，使得修饰和纯化过程在同一层析柱上完成，大大简化了生产工艺流程，减少了工艺步骤，降低了生产成本，提高了生产效率。相比于现有技术中复杂的化学修饰过程，本发明的方法更为简单、快速和高效。
33、4.提高sod的安全性：与现有技术中使用的多种具有生物毒性的化学修饰剂不同，本发明采用供氢体(如壳聚寡糖、氨基葡聚糖)作为修饰剂，这些材料无毒、无害，显著提高了修饰后sod的安全性，减少了潜在的副作用，适合在医疗领域的应用。
34、5.提高sod的生物相容性：本发明通过定点修饰sod的16q、154q位点，确保了修饰后sod的生物相容性更好，减少了外源性sod引发免疫反应的风险，有利于其在体内长时间发挥作用，特别适用于放疗防护领域。
35、6.提供额外的电子以中和自由基：本发明中的供氢体修饰sod不仅能够清除超氧阴离子自由基，还可以通过供氢体提供额外的电子，中和羟基自由基和其他衍生的自由基，提高了整体的抗氧化效果，增强了放疗防护的效果。
36、7.广泛的应用前景：本发明的供氢体修饰sod不仅在放疗防护中表现出色，特别是在皮肤和直肠的防护方面，而且其稳定性和高效的抗氧化性能使其在其他医疗和保健领域也具有广泛的应用前景。
37、总之，本发明通过供氢体修饰sod，由具有提供额外电子的多元醇及多糖通过对sod的结构中暴露于外部的16q、154q位点进行定点修饰，修饰后的sod不仅在稳定性上有一定提高，还增加sod抗h2o2及清除羟基自由基的性能；本发明所公布的修饰方法采用柱上亲和-修饰-纯化一体式的方式，简化了修饰sod的生产工艺，克服了现有技术中的多个缺点，提供了一种更加高效、稳定、安全和经济的sod修饰方法，显著提高了sod在放疗防护及其他领域的应用效果。
1.一种供氢体修饰的sod制备方法及其在放疗防护领域的应用，其特征在于，所述供氢体修饰的sod为从植物提取、动物血液提取的cu/zn-sod或人源重组表达的cu/zn-sod。
2.根据权利要求1所述的供氢体修饰的sod制备方法及其在放疗防护领域的应用，其特征在于，所述人源重组表达的cu/zn-sod氨基酸序列基于genbank中的人源cu/zn-sod(aar21563.1)，经swiss-model及swiss-pdbviewer软件建模，对其氨基酸序列、蛋白空间结构及活性中心进行预测后，对氨基酸序列进行以下突变：c7a、e25g、p29t、e101v、c112s，形成sod*氨基酸序列pro-seq1，所述的sod*氨基酸根据原核表达系统大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化，获得突变型的sod编码基因序列dna-seq 1，将dna-seq1序列经合成后定向插入定向插于pet28a载体的nde i与xho i之间，形成pet-28a-sod*质粒，转入大肠杆菌bl21(de3)，经验证后进行发酵培养，低温诱导表达。
3.根据权利要求2所述的供氢体修饰的sod制备方法及其在放疗防护领域的应用，其特征在于，人源重组表达的cu/zn-sod氨基酸序列(aar21563.1)为：
4.根据权利要求2所述的供氢体修饰的sod制备方法及其在放疗防护领域的应用，其特征在于，所述的供氢体修饰sod的方法包括对sod蛋白的氨基酸残基进行缩合反应修饰、酰胺化反应修饰、转氨化反应、酶法修饰中的一种或多种组合，所述的酶法修饰采用谷氨酰胺转氨酶，使用浓度为0.1％～5％。
5.根据权利要求2所述的供氢体修饰的sod制备方法及其在放疗防护领域的应用，其特征在于，供氢体对sod修饰的主要修饰位点为赖氨酸残基、谷氨酰胺残基中的一种或多种组合，所述谷氨酰胺残基修饰位点为16q、23q、154q，中的一种或多种组合。
6.根据权利要求1所述的供氢体修饰的sod制备方法及其在放疗防护领域的应用，其特征在于，供氢体通式为r-nh2，其中r为多元醇或者多糖结构，主要由氨基甘露糖、氨基葡聚糖、壳聚寡糖、聚乙二醇氨等中的一种或多种组成，r1-nh2由甘露醇、氨基甘露糖、壳聚寡糖、氨基葡聚糖等中的一种或多种组成，工作浓度为0.1％-0.5％。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的供氢体修饰的sod制备方法及其在放疗防护领域的应用，其特征在于，所述供氢体修饰sod的修饰及纯化工艺采用柱上修饰-纯化方法，所述柱上修饰-纯化方法利用亲和层析方式，亲和填料采用螯合铜离子的cheating-sepharose。
8.根据权利要求7所述的供氢体修饰的sod制备方法及其在放疗防护领域的应用，其特征在于，所述柱上修饰-纯化方法包括以下步骤：
9.根据权利要求1所述的供氢体修饰的sod制备方法及其在放疗防护领域的应用，其特征在于，供氢体修饰的sod在放疗防护方面特别是皮肤防护方面的应用，配合修复液使用，修复液由10-50mm磷酸盐缓冲液(ph5.5±0.5)、1-5％甘油或山梨醇、0.01％-0.05％vb12、0.05-0.2％山梨酸钾组成。
10.根据权利要求1所述的供氢体修饰的sod制备方法及其在放疗防护领域的应用，其特征在于，供氢体修饰的sod在放疗防护方面特别是直肠防护的应用，配合修复液使用，修复液由10-50mm磷酸盐缓冲液(ph7.0-7.2)、1-5％甘油或山梨醇、15-25％泊洛沙姆、0.01％-0.05％vb12、0.05-0.2％山梨酸钾组成。
