本发明属于镰刀菌酸检测，具体涉及一种电化学发光检测镰刀菌酸探针及其制备方法和应用。
背景技术：
1、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum f.sp.croci)是一种专化性病原菌，能够引起西红花(crocus sativus)根腐病，而镰刀菌酸(fumonisin b1)是尖孢镰刀菌产生的一种主要有毒代谢产物，对西红花的生长和健康构成威胁。目前对镰刀菌酸的检测手段主要有高效液相色谱-质谱联用技术(hplc-ms/ms)、酶联免疫吸附测定(elisa)、液相色谱-荧光检测(hplc-fld)。但这些方法都具有一定缺陷。例如，hplc-ms/ms和elisa等方法通常需要昂贵的仪器和专业的操作人员，这增加了检测的成本和复杂性。在进行检测之前，需要对样本进行适当的前处理，如提取、净化等，这些步骤可能会导致样本损失或引入杂质，影响检测结果的准确性。尽管这些检测方法的灵敏度已经很高，但在某些情况下，尤其是在病原体含量较低的早期感染阶段，可能仍然难以检测到镰刀菌酸的存在。某些检测方法可能对镰刀菌酸以外的类似化合物也有反应，这可能导致假阳性结果，影响检测的准确性。土壤和植物组织中的其他成分可能会干扰镰刀菌酸的检测，特别是在复杂基质中，如西红花根组织，这可能需要额外的样品处理步骤来消除干扰。
2、此外，为开发新的检测技术，已开始基于试纸条进行各种技术耦合的研究，以建立多功能试纸条实现镰刀菌酸的定量检测。现有的lfi基联用技术，包括，lfi-荧光法(flfi)联用技术、lfi-化学发光法(cllfi)联用技术、lfi-拉曼散射传感法(slfi)联用技术、lfi-电化学(elfi)联用技术等。虽然这些联用技术在一定程度上有效地提高了检测灵敏度，但仍存在背景光干扰(自身荧光和散射光)或环境稳定性不佳等问题。
技术实现思路
1、基于现有技术中存在的上述缺点和不足，本发明的目的之一是至少解决现有技术中存在的上述问题之一或多个，换言之，本发明的目的之一是提供满足前述需求之一或多个的一种电化学发光检测镰刀菌酸探针及其制备方法和应用，应用主要为电化学发光成像试纸条的构建以及镰刀菌酸检测方法。
2、第一方面，本发明提供了一种电化学检测镰刀菌酸探针的制备方法，包括以下步骤：
3、将[fe(bpy)3]2+和paa溶液作为前驱体，反应得到fe-paa配合物；
4、将fe-paa配合物、水、氨水、乙醇混合后，搅拌，再加入tmos，于黑暗下搅拌反应，得到fe-paa@sio2溶液；
5、将含金化合物加入至fe-paa@sio2溶液，于50～70℃下搅拌，再加入亚硫酸钠，继续搅拌，离心洗涤后分散至水中，得到fe-paa@sio2@au；
6、将fe-paa@sio2@au与镰刀菌酸抗体混合，得到混合溶液；
7、将混合溶液于20～25℃下孵育1.5～3h，然后加入bsa溶液，继续孵育20～40min，收集得到anti-镰刀菌酸-fe-paa@sio2@au共轭物，重悬于mes中，即得电化学发光检测镰刀菌酸探针。
8、优选的，[fe(bpy)3]2+溶液与dic/hosu混合溶液混合搅拌需30～40min，制备fe-paa配合物需在2～6℃下反应4～8h；
9、优选的，[fe(bpy)3]2+溶液浓度为0.005～0.02m，paa溶液浓度为15～25mg/ml，dic/hosu混合溶液中dic浓度为0.001～0.003m、hosu浓度为0.004～0.012m。
10、优选的，fe-paa配合物、水、氨水、乙醇混合后需搅拌10～30min，加入tmos后需在20～25℃黑暗下搅拌反应10～15h，氨水的质量浓度为25～28％。
11、优选的，含金化合物包括haucl4、kaucl4、naaucl4中的至少一种，含金化合物溶液加入至fe-paa@sio2溶液后需于50～70℃下搅拌，离心速率为10000～12000r/min含金化合物溶液质量浓度为5～15％，亚硫酸钠溶液质量浓度为0.5～2％。
12、优选的，fe-paa@sio2@au与镰刀菌酸抗体混合溶液中镰刀菌酸抗体浓度为0.05～0.22mg/ml，bsa溶液的质量浓度为5～20％，anti-镰刀菌酸-fe-paa@sio2@au共轭物重悬于mes中使用的mes浓度为0.05～0.2m，体积为1～3ml。
13、第二方面，本发明还提供了一种电化学发光检测镰刀菌酸的试纸条，包括：
14、基板，其表面设有工作电极、参比电极和对电极；
15、玻璃纤维膜，所述玻璃纤维膜表面分别喷涂有镰刀菌酸-bsa、兔抗鼠igg以形成测试线和质控线；
16、所述玻璃纤维膜背离测试线的表面与所述基板设有工作电极的表面相贴合，所述测试线与所述工作电极正对设置；
17、样品垫，其一侧与所述玻璃纤维膜贴合、另一侧与所述基板贴合；
18、吸收垫，其一侧与所述玻璃纤维膜贴合、另一侧与所述基板贴合；
19、所述样品垫、吸收垫分别位于所述玻璃纤维膜两侧；
20、pva溶液池，其贴合在所述玻璃纤维膜上，所述pva溶液池上对应基板的工作电极、参比电极和对电极处开设有通孔以向所述pva溶液池内加入pbs缓冲液；
21、还包括如上方案所述的电化学发光检测镰刀菌酸探针。
22、优选的，所述样品垫的制备方法为：将样品垫置于缓冲溶液中浸泡20～40min后，干燥，得到样品垫；所述缓冲溶液包括mes、simulsolsl11w和nacl，其中，缓冲溶液中mes浓度为0.01～0.03m、simulsolsl11w质量浓度为0.1～0.4％、nacl浓度为0.1～0.3m。
23、优选的，所述的电化学发光检测镰刀菌酸的试纸条基板上工作电极、参比电极和对电极的材料均为导电碳油墨。
24、第三方面，本发明还提供了一种电化学发光检测镰刀菌酸的方法，基于如上任一项方案所述的试纸条，所述镰刀菌酸检测方法包括以下步骤：
25、步骤1：将待测溶液与制备的电化学发光检测镰刀菌酸探针混合得到待测样品，滴加在试纸条的样品垫上，通过测试线颜色变化定性检测待测样品中镰刀菌酸；
26、步骤2：向试纸条的玻璃纤维膜对应测试线区域滴加pbs缓冲液，将工作电极、参比电极和对电极与电化学工作站连接，通过电化学发光成像信号强度以进行待测样品中镰刀菌酸的定量检测。
27、本发明与现有技术相比，有益效果是：
28、(1)本发明的电化学发光检测镰刀菌酸探针的制备方法，利用酰胺反应合成了fe-paa配合物，具体的，将[fe(bpy)3]2+水溶液与paa水溶液混合搅拌，最终得到fe-paa配合物；然后，用水解法合成fe-paa@sio2，再在其表面原位还原haucl4，得到fe-paa@sio2@au；向fe-paa@sio2@au中加入镰刀菌酸抗体，搅拌，得到anti-afb-fe-paa@sio2@au共轭物，用bsa封闭多余位点，得到镰刀菌酸响应双信号探针，用于镰刀菌酸的检测；
29、(2)本发明的电化学发光成像试纸条，构建了与电极一体化的试纸条，通过输出电化学发光成像与比色两种可视化信号，实现本发明试纸条两个信号间的相互验证，保证信号的准确性。同时，由于电化学发光具有背景信号低、灵敏度高、电位可控等优点，使用电化学发光成像信号提高了传统侧流层析试纸条的灵敏度；
30、(3)本发明的镰刀菌酸检测方法，使用电化学发光成像与免疫层析试纸条法相结合对进行检测，该方法的检测限低，灵敏度和准确度高，镰刀菌酸检测的比色信号线性检测范围为1ng/ml～100ng/ml，比色检测限(vlod)为0.103ng/ml，ecl成像信号的线性检测范围为0.1ng/ml～100ng/ml，ecl成像检测限(ecllod)为0.012ng/ml，可利用比色信号实现对镰刀菌酸的快速预判、筛选，随后通过ecl成像对目标物实现精确定量。
1.一种电化学发光检测镰刀菌酸探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中fe-paa配合物的配制方包括：将[fe(bpy)3]2+溶液与dic/hosu混合溶液混合后搅拌20～40min，加入paa溶液后于2～6℃下反应4～8h得到；其中，所述[fe(bpy)3]2+溶液浓度为0.005～0.02m，dic/hosu混合溶液中dic浓度为0.001～0.003m、hosu浓度为0.004～0.012m，paa溶液浓度为15～25mg/ml。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中将fe-paa配合物、水、氨水、乙醇混合后的搅拌时间为20～30min，加入tmos后于20～25℃黑暗下搅拌15～20h；其中，所述氨水的质量浓度为25～28％。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中将含金化合物加入fe-paa@sio2溶液后搅拌温度为50～70℃，加入亚硫酸钠溶液搅拌后以10000～12000r/min速率离心洗涤后分散至水中；其中，所述含金化合物包括haucl4、kaucl4、naaucl4中的至少一种，所述含金化合物质量浓度为5～15％，亚硫酸钠溶液质量浓度为0.5～2％。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述镰刀菌酸抗体浓度为0.05～0.2mg/ml，bsa溶液的质量浓度为5～20％；所述mes浓度为0.05～0.2m，体积为1～3ml。
6.如权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的电化学发光检测镰刀菌酸探针。
7.一种电化学发光检测镰刀菌酸的试纸条，其特征在于，包括：基板，其表面设有工作电极、参比电极和对电极；玻璃纤维膜，所述玻璃纤维膜表面分别喷涂有镰刀菌酸-bsa、兔抗鼠igg以形成测试线和质控线；所述玻璃纤维膜背离测试线的表面与所述基板设有工作电极的表面相贴合，所述测试线与所述工作电极正对设置；样品垫，其一侧与所述玻璃纤维膜贴合、另一侧与所述基板贴合；吸收垫，其一侧与所述玻璃纤维膜贴合、另一侧与所述基板贴合；所述样品垫、吸收垫分别位于所述玻璃纤维膜两侧；pva溶液池，其贴合在所述玻璃纤维膜上，所述pva溶液池上对应基板的工作电极、参比电极和对电极处开设有通孔以向所述pva溶液池内加入pbs缓冲液；
8.如权利要求7所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫的制备方法为：将样品垫置于缓冲溶液中浸泡20～40min后，干燥，得到样品垫；所述缓冲溶液包括mes、simulsolsl11w和nacl，其中，缓冲溶液中mes浓度为0.01～0.03m、simulsolsl11w质量浓度为0.1～0.4％、nacl浓度为0.1～0.3m。
9.如权利要求7所述的试纸条，其特征在于，所述工作电极、参比电极和对电极的材料均为导电碳油墨。
10.一种一体化的镰刀菌酸检测方法，基于如权利要求7-9任一项所述的试纸条，其特征在于，所述镰刀菌酸检测方法包括以下步骤：
