本发明涉及一种用于10色荧光检测复合扩增matrix体系的荧光染料及构建方法建，属于荧光str分型。
背景技术：
1、短串联重复序列(简称str)也称为微卫星或简单序列重复(ssr)，是一类广泛存在于真核生物基因组中的dna串联重复序列，核心序列为2-6个碱基重复单位。str基因座数量大，分布广泛，约占整个基因组的3％，而且多态性高，其多态性主要源自核心序列重复次数在个体间的差异，并且这种差异在遗传过程中遵循孟德尔遗传规律。由于str位点具有高度的多态性，即在人群中同一位点的不同个体表现出多种不同的重复次数，这使得str成为法医dna鉴定中用于个体识别的理想标记之一。因此，str扩增检测技术被广泛用于个体识别、亲缘鉴定和群体遗传学研究。
2、荧光染料标记在dna检测中的应用是分子生物学领域的一个重要进展。荧光检测依赖于荧光基团在吸收光能后发射光的特性。荧光基团是一类特殊的分子，它们能够在吸收特定波长的光后，以较长的波长重新发射光。通过把荧光染料标记在寡核苷酸引物的5'端,扩增后,使相应pcr产物的一条链均携带标记引物的荧光染料。这些带有特定荧光物质的扩增产物在后续的电泳分离检测设备上,可被清晰识别。通过测量荧光信号的变化来检测和分析dna的存在、结构和功能。在str分析中，通常使用多色荧光标记的引物来同时扩增多个str位点。这些荧光标记具有不同的激发和发射光谱，使得在单一实验中可以同时检测多个str位点。例如，常用的荧光染料包括fam、hex、tet和vic等，它们分别对应于不同的颜色通道。但在选择荧光染料组合时，应考虑到不同荧光染料的发射波长，相差越大越好，以减少相互干扰。
3、目前市场上主流的str试剂盒大多基于五色或六色荧光复合扩增技术。这些试剂盒能够同时检测一定数量的str位点，通常在20-44个之间。虽然这一技术已经能够满足大部分常规法医dna分析的需求，但在面对复杂样本，如微量dna、降解dna或混合dna等情况时，其局限性变得尤为明显。五色或六色荧光系统的通道数量限制了可以同时检测的str位点数，这可能导致信息的丢失或分辨率的不足。此外，当扩增的dna片段长度超过300bp时，较长片段的扩增效率通常较低，容易出现丢峰现象，这进一步影响了数据的准确性和可靠性。
4、随着法医dna分析需求的不断增长以及技术的持续进步，传统的五色或六色荧光复合扩增技术已无法完全满足复杂案件处理的需求。因此，开发基于更多荧光通道的str试剂盒具有重要的实际意义。
技术实现思路
1、本发明提供一种10色荧光检测复合扩增matrix体系的构建方法，突破现有的五色或六色荧光dna检测技术的限制，扩展荧光通道和基因座数目，极大提升荧光dna检测的效率和能力。
2、为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
3、一种用于10色荧光检测复合扩增matrix体系的荧光染料，10种染料包括fam、tet、hex、er650、er652、er663、er664、er674、er685和er690，10种荧光发射光谱能区分开且不相互渗透，10种荧光染料是经过优化筛选，波长在480-710范围，各染料的具体化学结构式如下：
4、
5、
6、式中an-为化学式中所带荧光基团。
7、本发明具有以下优点：(1)本matrix体系为国内首创10色体系；(2)10种荧光发射光谱能区分开且不相互渗透；(3)10种荧光发射强度强，各色均匀；(4)可兼容80个以上的基因座，提升检测效率。(5)可以容纳更多小片段，有利于提升案件降解样本的检出率。
8、一种用于10色荧光检测复合扩增matrix体系的构建方法，使用fam、tet、hex、er650、er652、er663、er664、er674、er685和er690，10种染料进行组合标记，经进一步对荧光能量转移染料的筛选和荧光基团标记方式的优化，建立了10色荧光分析体系，10种荧光发射光谱能区分开且不相互渗透。
9、上述用于10色荧光检测复合扩增matrix体系的构建方法，具体步骤如下：
10、1)选择10种荧光染料：fam、tet、hex、er650、er652、er663、er664、er674、er685和er690，其中，fam、tet、hex、er650、er652、er663、er664、er674、er685用于对扩增引物进行标记，er690用于标记内标；
11、2)matrix引物设计：以随机质粒800为模板，上游引物序列固定，分别设计10个片段大小为80bp，100bp，120bp，140bp，160bp，180bp，200bp，220bp，260bp和280bp的下游引物序列；
12、3)matrix pcr扩增和组配：pcr扩增10个片段，包含fam、tet、hex、er650、er652、er663、er664、er674、er685和er690共10种荧光染料标记的片段各一份，且各片段的分子量大小至少相差20bp；
13、4)调整10个片段的峰高均衡性，10色matrix标准品组建成功。
14、上述步骤1)中10种荧光染料激发及发射波长如下：
15、
16、
17、上述步骤2)中设计的引物序列如下表：
18、
19、上述引物由本公司引物合成部进行合成。
20、上述步骤2)中随机质粒800的序列为：
21、ggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgacgattattgagggtgcgcaggaggtgctggaagctctggtgaatttctgcctcagaagtctccgtgaggttgaacttgaggcctttgagaatctctgtcagggtggtattatgggcccccagagacaggaaggccaaggcggtggagatgctcagtggggagaagatgacattcttatcaggggccttcaggactaactgcttgtacaggctgaaagcgaagtccacgttggcggaggctaatccgaggtccacgtgtgtccctcggtcttggttctcctgggtcagattctcctcgtcaagtgggctgttagggtggcagaggacagcagggcagaacccagccgccaagagccccagagtcaggagaggtaacattctctccattctcaactctgcctcagggagctggatgtagctggtggattccaaagcggacgcgtgggtcgacccgggaattccggaccggtacctgcaggcgtaccagctttccctatagtgagtaatctctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgta。
22、上述步骤3)中，pcr扩增的pcr总体积为50ul，其中，pcr mix 20ul，taq聚合酶0.5ul，标记引物1ul，非标引物2.5ul，dna模板1ul，补水至50ul；pcr程序为：95℃3min；94℃30s，62℃30s，72℃45s，共35循环；72℃15min，4℃保存pcr产物。
23、上述步骤4)的具体步骤为：将扩增获得的10种荧光染料标记的片段混合，使用溯远基因honor1816型遗传分析仪进行毛细管电泳并收集数据，按照仪器的光谱模式进行光谱校正，根据电泳结果的各色的荧光信号强度，调整10个片段的加量比例，使峰高均衡性一致，10色matrix标准品组建成功。
24、本发明未提及的技术均参照现有技术。
25、目前，尚无公开的10色荧光检测系统，本发明提供的10色荧光复合扩增技术相较于现有技术，具有以下有益效果：
26、(1)本matrix体系为国内首创10色体系；
27、(2)10种荧光染料发射光谱能够区分且互不渗透；
28、(3)10种荧光发射强度高，均衡性好；
29、(4)可兼容更多的str基因座，检测效率、准确性和分辨率高，提供了更为丰富的遗传信息；
30、(5)可容纳更多小片段，极大提高微量样本、降解样本等疑难样品检出率，减少了大片段丢峰的可能性；
31、(6)促进了法医学领域的技术创新，推动了dna分析技术向更高精度和更广应用范围的发展。
32、综上所述，推出10色荧光复合扩增技术是对现有技术的重要补充和升级，它不仅能够解决现有技术的局限性，而且为更复杂的法医dna分析需求提供了强有力的工具。
1.一种用于10色荧光检测复合扩增matrix体系的荧光染料，其特征在于：10种染料包括fam、tet、hex、er650、er652、er663、er664、er674、er685和er690，10种荧光发射光谱能区分开且不相互渗透，10种荧光染料波长在480-710范围，各染料的具体化学结构式如下：
2.一种用于10色荧光检测复合扩增matrix体系的构建方法，其特征在于：使用fam、tet、hex、er650、er652、er663、er664、er674、er685和er690，10种染料进行组合标记，建立了10色荧光分析体系，10种荧光发射光谱能区分开且不相互渗透。
3.如权利要求2所述的用于10色荧光检测复合扩增matrix体系的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
4.如权利要求3所述的用于10色荧光检测复合扩增matrix体系的构建方法，其特征在于：步骤1)中10种荧光染料激发及发射波长如下：
5.如权利要求3或4所述的用于10色荧光检测复合扩增matrix体系的构建方法，其特征在于：步骤2)中设计的引物序列如下表：
6.如权利要求3或4所述的用于10色荧光检测复合扩增matrix体系的构建方法，其特征在于：步骤3)中，pcr扩增的pcr总体积为50ul，其中，pcr mix 20ul，taq聚合酶0.5ul，标记引物1ul，非标引物2.5ul，dna模板1ul，补水至50ul；pcr程序为：95℃3min；94℃30s，62℃30s，72℃45s，共35循环；72℃15min，4℃保存pcr产物。
7.如权利要求3或4所述的用于10色荧光检测复合扩增matrix体系的构建方法，其特征在于：步骤4)为：将扩增获得的10种荧光染料标记的片段混合，使用溯远基因honor1816型遗传分析仪进行毛细管电泳并收集数据，按照仪器的光谱模式进行光谱校正，根据电泳结果的各色的荧光信号强度，调整10个片段的加量比例，使峰高均衡性一致，10色matrix标准品组建成功。
8.如权利要求3或4所述的用于10色荧光检测复合扩增matrix体系的构建方法，其特征在于：10色matrix标准品兼容80个以上的基因座。
