本发明涉及pbmcs复合脱细胞神经支架的制备方法与应用，属于神经组织工程领域。
背景技术：
1、周围神经损伤(peripheral nerve injury，pni)是一种常见的临床问题，据报道，约占所有创伤患者的2.8％[1]。神经功能丧失会导致肢体麻木、运动功能丧失以及不可逆的肌肉萎缩等情况，严重影响患者的生活质量[2]。目前主要依赖外科手段治疗周围神经损伤，通过无张力的缝合神经断端重新恢复神经的连续性，当长距离神经缺损无法缝合时，自体神经移植是目前的金标准治疗，但因存在着供体神经数量不足、受区神经不匹配、供区丧失神经功能等问题而受限于临床[3]。目前还存在因可供移植的神经数量不足得不到有效治疗或切取后残留感觉运动功能障碍的患者，因此，寻找理想的自体神经替代物代替自体神经移植，修复周围神经缺损，提高患者生活质量具有重要意义[4]。
2、以脱细胞神经作为支架复合种子细胞修复神经缺损是当前主要趋势之一。大量研究表明，基于细胞的脱细胞神经支架修复周围神经缺损是安全有效的[5–7]。目前已被利用的细胞包括施万细胞及各类干细胞如：脂肪源性干细胞、神经干细胞、间充质干细胞。研究表明，复合了种子细胞的神经支架更有利于神经的再生及功能恢复，可克服长距离再生困难的难题[8–10]。不过此类干细胞均有着共同的缺点，取材困难、数量有限、对机体损伤大、存在致瘤性以及涉及伦理、法律问题等。虽然此类复合干细胞的神经支架可促进神经损伤的再生及功能恢复，但难达自体神经移植治疗效果，需要继续寻找更为理想的种子细胞促进周围神经损伤修复。
3、外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,pbmcs)即外周血中具有单个核的细胞，主要包括大量的单核细胞和淋巴细胞，也含有少量造血干细胞、血管内皮组细胞、间充质干细胞等，这类细胞有自我更新能力，且具有在特定微环境或细胞因子诱导下分化为神经细胞的能力；与干细胞相比，pbmcs还具备取材方便、对机体损伤小、不涉及伦理等优点。本课题组前期的实验研究发现[11–13]：pbmcs可促进坐骨神经离断吻合模型大鼠坐骨神经的生长以及运动功能的恢复，提示pbmcs对坐骨神经损伤的治疗有很好的应用前景。但作为种子细胞构建复合pbmcs的脱细胞同种异体神经支架修复周围神经缺损的研究未见报道。
技术实现思路
1、本发明所要解决的是为复合pbmcs的脱细胞神经支架对周围神经缺损后再生修复的技术问题。
2、为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：pbmcs复合脱细胞神经支架的制备方法，包括如下步骤：
3、步骤一：将同种异体坐骨神经显微镜下去除坐骨神经结缔组织、脂肪后，置于-80℃冰箱冷冻6小时，取出后室温下于pbs中复水，按sondell法处理：蒸馏水浸泡7h，期间换水2次；振荡器中(150r/min)3％tritonx-100溶液消化12h；蒸馏水浸浴1h；振荡器中(150r/min)4％脱氧胆酸钠溶液消化24h；
4、步骤二：重复以上步骤1次，蒸馏水清洗，置于pbs溶液中4℃即得pbmcs复合脱细胞神经支架备用；
5、步骤三：将步骤二所得pbmcs复合脱细胞神经支架存放于多聚甲醛固定24h，石蜡包埋、切片、he染色鉴定脱细胞效果。
6、步骤四：采用聚蔗糖-泛影葡胺分层液法分离提取pbmcs；
7、步骤五：以脱细胞神经支架桥接周围神经缺损，并用注射器于支架处多点注射pbmcs悬液0.2ml约(2×106个)。
8、所述的pbmcs复合脱细胞神经支架在制备治疗周围神经缺损中的应用。
9、采用上述技术方案的有益效果是：
10、1.本发明明确了外周血单个核细胞可作为种子细胞构建复合pbmcs的脱细胞同种异体神经支架修复大鼠坐骨神经缺损，可促进大鼠坐骨神经再生以及神经肌肉功能恢复。
11、2.本发明扩大了pbmcs的应用范围，为pbmcs作为种子细胞构建组织工程神经应用于临床治疗周围神经缺损提供了理论依据。
1.pbmcs复合脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的pbmcs复合脱细胞神经支架在制备治疗周围神经缺损中的应用。
