本发明属于生物医用材料，尤其涉及一种神经再生支架及其制备方法和应用。
背景技术：
1、神经再生支架是一种用于修复受损神经的重要材料，理想的神经再生支架应具备以下几个特点：①良好的生物相容性或生物安全性：支架或其降解产物对机体无毒，具有较低的宿主免疫反应；②适当的结构和良好的通透性：支持氧气、营养素运输，实现并维持细胞间的相互作用；③与修复区组织细胞生长速度相匹配的生物降解速率，并可以被完全吸收或安全的排出体外；④合适的力学强度和可塑性：支架起到机械支撑作用，必须具有良好的力学性能。
2、在神经损伤的研究中，脊髓损伤是一种严重的神经系统创伤后并发症，极易造成损伤节段以下神经功能障碍，具有致残率高和功能恢复难的特点。目前，脊髓损伤后的临床治疗主要通过手术解除压迫、稳定脊柱结构及激素治疗等，尚缺少有效促进神经再生和恢复功能的治疗方案，如何对损伤脊髓进行有效的修复治疗已经成为临床研究工作中最具挑战性的科学问题之一。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种神经再生支架，该支架具有良好的神经修复和再生效果。
2、本发明的目的之二在于提供一种上述神经再生支架的制备方法。
3、本发明的目的之三在于提供一种上述神经再生支架在制备神经修复材料中的应用。
4、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
5、本发明的第一方面提供了一种神经再生支架，包括层叠的第一凝胶层和第二凝胶层；所述第一凝胶层的制备原料包括蛋白包被的锗纳米颗粒和第一水凝胶预聚物，所述第二凝胶层的制备原料包括还原型氧化石墨烯和第二水凝胶预聚物，所述第一水凝胶预聚物和第二水凝胶预聚物相同或不同。
6、在本发明中，锗纳米颗粒作为高效的光声剂，其产生的光声刺激对神经元是一种非侵入性、精确的神经刺激，能够将光转换为声波，促进轴突伸长，进一步促进神经再生以及功能恢复；采用蛋白对锗纳米颗粒进行包被，能够有效降低纳米颗粒的细胞毒性，提高材料的生物相容性，且其光热稳定性明显增强，同时具有宽光谱范围内的高摩尔消光系数(即更高的光吸收能力)，因此相比于未包被的锗纳米颗粒，蛋白包被的锗纳米颗粒具有更强的光声效应。另外，本发明的还原型氧化石墨烯(rgo)是由氧化石墨烯(go)还原后获得的，相比于石墨烯和go，rgo具有更好的生物相容性、生物活性和分散性，且在保留了go良好的生物亲和性的基础上，具有更优异的电学、热学和机械性能，同时其对生物膜等的氧化及破坏作用相较于go具有明显改善，因此相较于石墨烯和go，rgo在本发明中有明显的优异性，更有利于传递锗纳米颗粒所产生的光声刺激，更大效率发挥光声效能。本发明通过锗纳米颗粒和还原型氧化石墨烯配合，能够有效促进受损神经的再生。
7、优选地，所述蛋白为白蛋白；进一步优选地，所述白蛋白包括牛血清白蛋白(bsa)、人血清白蛋白(hsa)或其组合。
8、bsa是一种应用广泛、容易获得、制备简单、价格合适的蛋白，经过bsa包被的锗纳米颗粒不仅能在较大程度上促进神经再生，同时其成本较低，最终实现临床转化及产业化具有重要优势。采用hsa等其他白蛋白也能实现良好的包被效果。
9、优选地，所述第一水凝胶预聚物和第二水凝胶预聚物各自独立地包括明胶类凝胶预聚物、多糖类凝胶预聚物或多肽类凝胶预聚物中的至少一种；进一步优选地，所述第一水凝胶预聚物和第二水凝胶预聚物各自独立地包括甲基丙烯酰化明胶、壳聚糖、透明质酸或导电聚吡咯中的至少一种；更进一步优选地，所述第一水凝胶预聚物和第二水凝胶预聚物各自独立地选自甲基丙烯酰化明胶(gel ma)。
10、采用水凝胶作为锗纳米颗粒和还原型氧化石墨烯的载体，可以获得良好的材料分散性，同时不影响其光声效果，且其制备过程简单，应用优势明显。
11、优选地，所述第一凝胶层和所述第二凝胶层的质量比为1：(0.1～5)；进一步优选为1：(0.2～4)；更进一步优选为1：(0.3～3)；非限制性示例如1：0.5、1：1、1：2或1：2.5。
12、优选地，所述第一凝胶层的制备原料中，所述蛋白包被的锗纳米颗粒和所述第一水凝胶预聚物的质量比为1：(50～150)；进一步优选为1：(80～120)；非限制性示例如1：90、1：100或1：120。
13、优选地，所述第二凝胶层的制备原料中，所述还原型氧化石墨烯和所述第二水凝胶预聚物的质量比为1：(50～150)；进一步优选为1：(80～120)；非限制性示例如1：90、1：100或1：120。
14、本发明的第二方面提供了一种如本发明的第一方面所述的神经再生支架的制备方法，包括以下步骤：将含有所述蛋白包被的锗纳米颗粒和所述第一水凝胶预聚物的第一混合液进行第一固化后，得到所述第一凝胶层；将含有所述还原型氧化石墨烯和所述第二水凝胶预聚物的第二混合液进行第二固化后，得到所述第二凝胶层；将所述第一凝胶层和所述第二凝胶层层叠，得到所述的神经再生支架。
15、优选地，所述第一混合液中，所述蛋白包被的锗纳米颗粒的浓度为0.1～5mg/ml；进一步优选为0.2～4mg/ml；更进一步优选为0.3～3mg/ml；非限制性示例如0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml或2.5mg/ml。
16、优选地，所述第二混合液中，所述还原型氧化石墨烯的浓度为0.1～3mg/ml；进一步优选为0.2～2.5mg/ml；更进一步优选为0.3～2mg/ml；非限制性示例如0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml或1.8mg/ml。
17、优选地，所述第一固化和所述第二固化的方式各自独立地选自光固化。
18、优选地，所述第一混合液中还包括第一光引发剂；在本发明的一些具体实施方式中，所述第一光引发剂选自苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(lap)。
19、优选地，所述第一混合液中还包括第一溶剂；在本发明的一些具体实施方式中，所述第一溶剂选自磷酸盐缓冲液(pbs)。
20、优选地，所述第二混合液中还包括第二光引发剂；在本发明的一些具体实施方式中，所述第二光引发剂选自苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(lap)。
21、优选地，所述第二混合液中还包括第二溶剂；在本发明的一些具体实施方式中，所述第一溶剂选自磷酸盐缓冲液(pbs)。
22、本发明的第三方面提供了一种如本发明的第一方面所述的神经再生支架在制备神经修复材料中的应用。
23、优选地，所述神经再生支架中的第一凝胶层作为神经修复材料的表层，所述神经再生支架中的第二凝胶层作为神经修复材料的深层。
24、含有rgo的第二凝胶层作为神经修复材料的深层，具有合适的弹性模量且不影响光声传递，能抵抗锗纳米颗粒产生的应力刺激，提供了显著的促进神经再生的微环境，有利于调节雪旺细胞的行为、轴突的延伸和巨噬细胞的表型，从而加快神经再生的进程。
25、优选地，所述神经修复材料为脊髓神经修复材料。
26、本发明的有益效果是：本发明采用蛋白包被的锗纳米颗粒和还原型氧化石墨烯分别作为第一凝胶层和第二凝胶层的活性成分，能够有效发挥锗纳米颗粒的光声效应和还原型氧化石墨烯的机械性能及电化学活性，共同促进神经的修复再生，本发明提供的神经再生支架在制备神经修复材料尤其是脊髓神经修复材料中具有广泛的应用。
27、具体而言，与现有技术相比，本发明具有以下优点：
28、1、锗纳米颗粒是一种高效的光声剂，可以提供可重复的光声刺激，将红外光吸收并转化为热能，随后发生热胀冷缩并向外辐射出声波，这种声波的刺激有利于神经元轴突的伸长。值得注意的是，锗纳米颗粒还具有抗氧化性，能够在神经损伤尤其是脊髓损伤中抑制氧化应激，可以有效降低神经细胞的细胞内活性氧水平，降低活性氧对细胞的损伤，最终有利于神经再生。而且，锗纳米颗粒具有良好的导电性、生物相容性、生物降解性和抗菌活性，是一种很有前途的组织工程材料，利用锗纳米颗粒可以作为电刺激和光遗传学等的替代方案，不需要经皮电线连接或植入神经导电装置，不仅操作方便，而且减少了感染的风险。另外，锗纳米颗粒作为光声剂，能够利用声波作为载体进行成像，可提供脊髓损伤中新生血管、组织充血等功能信息，有利于评估神经再生支架的治疗效果，并具有监测神经恢复情况的作用。
29、2、由于纳米材料的毒性是限制材料临床应用的关键，因此本发明采用了蛋白(如bsa)对锗纳米颗粒进行包被，能够有效降低锗纳米颗粒的细胞毒性，提高生物相容性，且锗纳米颗粒的光热稳定性明显增强，具有宽光谱范围内的高摩尔消光系数(即更高的光吸收能力)，光声效应更强，具有更好的神经修复再生效果。
30、3、还原型氧化石墨烯(rgo)由氧化石墨烯(go)还原后得到，其分散性、溶解性和导电性优于氧化石墨烯，并且具有良好的生机械性能、生物相容性、抗菌活性和促血管生成能力。相较于石墨烯，rgo的生物安全性和生物活性较好，由于石墨烯在合成过程中存在大量的杂质，导致其生物安全性和生物活性较差，生物应用范围狭窄；相较于go，由于rgo是由go还原得到的，还原过程中会在表面形成大量的氧空位和缺陷，因此rgo具有较高的生物活性，其对生物膜等的氧化及破坏作用也有所改善，以及具有更优异的电学、热学和机械性能。另外，rgo具有与周围损伤组织相近的机械强度，组织顺应性强，可以促进血液中巨噬细胞的迁移和粘附，使其在神经损伤处聚集，加快神经再生的进程。
31、4、采用第一水凝胶和第二水凝胶作为载体，其表面具有的多孔结构有利于锗纳米颗粒和rgo的均匀分布，从而有利于锗纳米颗粒对近红外光的吸收，增加光声转换效率；以及有利于rgo充分发挥其电活性和化学活性，更大效率地发挥光声刺激所带来的神经刺激。
1.一种神经再生支架，其特征在于，包括层叠的第一凝胶层和第二凝胶层；所述第一凝胶层的制备原料包括蛋白包被的锗纳米颗粒和第一水凝胶预聚物，所述第二凝胶层的制备原料包括还原型氧化石墨烯和第二水凝胶预聚物，所述第一水凝胶预聚物和第二水凝胶预聚物相同或不同。
2.根据权利要求1所述的神经再生支架，其特征在于，所述蛋白为白蛋白，优选地，所述白蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白或其组合；
3.根据权利要求2所述的神经再生支架，其特征在于，所述第一水凝胶预聚物和第二水凝胶预聚物各自独立地包括甲基丙烯酰化明胶、壳聚糖、透明质酸或导电聚吡咯中的至少一种；优选为甲基丙烯酰化明胶。
4.根据权利要求1所述的神经再生支架，其特征在于，所述第一凝胶层和所述第二凝胶层的质量比为1：(0.1～5)；
5.一种如权利要求1～4任一项所述的神经再生支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有所述蛋白包被的锗纳米颗粒和所述第一水凝胶预聚物的第一混合液进行第一固化后，得到所述第一凝胶层；将含有所述还原型氧化石墨烯和所述第二水凝胶预聚物的第二混合液进行第二固化后，得到所述第二凝胶层；将所述第一凝胶层和所述第二凝胶层层叠，得到所述的神经再生支架。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第一混合液中，所述蛋白包被的锗纳米颗粒的浓度为0.1～5mg/ml；
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第一固化和所述第二固化的方式各自独立地选自光固化。
8.权利要求1～4任一项所述的神经再生支架在制备神经修复材料中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述神经再生支架中的第一凝胶层作为神经修复材料的表层，所述神经再生支架中的第二凝胶层作为神经修复材料的深层。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述神经修复材料为脊髓神经修复材料。
