本发明属于土壤生态风险评估，具体涉及一种基于微生物毒性测试评估苯并[a]芘的土壤生态风险的方法。
背景技术：
1、多环芳烃是一类重要的环境污染物，苯并[a]芘属于其中一种，具有强的致突变、致癌和致畸效应，来源主要是交通尾气、石油、煤和有机高分子化合物等有机物，由于其可以通过生物富集等方式长期存在于自然环境，如水体、土壤中而具有较大的风险。
2、现有技术中评估多环芳烃水体中的方法较多，例如曾勇，孙霄，赖雨薇，等人在生态毒理学报上所发表的基于物种敏感性分布的多环芳烃水生态系统风险评价方法与应用，基于美国生态毒理数据库(ecotox)，根据水生态系统各营养级功能组分类筛选，获得可靠的物种急、慢性毒性数据，以burrⅲ型分布拟合曲线，构建萘、芴、蒽、苊、芘、菲、苯并[a]芘和荧蒽这8种常见pahs的物种敏感性分布(ssd)曲线，结合急慢性比率系数法，外推出基于生态系统水平的慢性水质基准值，分别为0.25、6.75、0.06、1.95、0.03、3.50、0.05和0.50μg·l-1；并将计算结果与国内外已有基准/标准进行了对比，偏差不超过一个数量级，验证了计算结果的可靠性和准确性；公开号为cn103645286a的中国专利公开了一种水体中多环芳烃的生态风险确定方法，其步骤为：(1)筛选区域内水生态系统的代表性物种；(2)获得苯并[a]芘的毒性数据；(3)计算保护水生态系统中95％物种的苯并[a]芘浓度值hc5；(4)采样测定多环芳烃污染物种类及其相应的环境浓度，并分析各种多环芳烃的浓度分布特征；(5)计算特定多环芳烃类污染物的生态风险商值rqi；(6)计算总生态风险商值rqt，明确具体的生态风险。该技术方案可分析多环芳烃污染物所引发的潜在风险是否可接受，并判断水体生态风险总体水平是否应加以控制，为水生态系统的保护、多环芳烃污染控制措施的制定等提供科学依据。
3、上述技术方案中均采用了ssd，ssd是将各物种对某一特定化合物的毒性数据进行数学拟合，构建ssd曲线，由此确定一个可以保护生态系统大多数生物的安全浓度(hcp)，通常以hc5表示，即5％物种受到危害的浓度或保护95％物种的浓度，也是当前合理评估土壤生态风险的重要方法，也是常用方法，例如公开号为cn114049037a的中国专利，公开了一种场地复合污染土壤生态风险评估方法，该技术方案由单一物种的实验室毒性试验结果预测污染物对整个生态系统的生态效用，其hc5浓度可以保护95％的物种，即也是采用了ssd，但是ssd的合理性和科学性依赖于足够数量和质量的生态毒性数据。而随着经济的高速发展，工业生产和人类活动产生的通过各种途径进入土壤的污染物种类越来越多，与此相对的生态毒性数据的累积却缺乏常年的科研基础。目前由于缺乏苯并[a]芘足够可靠的毒性效应数据，关于土壤中苯并[a]芘的生态风险评估资料较少。
4、土壤是大自然中最复杂的生态系统之一，是人类赖以生存的物质基础，健康的土壤是保证粮食安全的关键，因此，提供一种新的评估苯并[a]芘的土壤生态风险具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明针对土壤苯并[a]芘生态毒性数据不足以支撑构建物种敏感性分布的问题，提供了一种基于微生物毒性测试评估苯并[a]芘的土壤生态风险的方法，该方法解决了当前土壤苯并[a]芘生态毒性数据不足以支撑构建物种敏感性分布的问题。
2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
3、本发明提供了一种基于微生物毒性测试评估苯并[a]芘的土壤生态风险的方法，包括以下步骤：
4、s1、对待评估土壤进行污染调查；
5、s2、采集待评估土壤和对照土壤；
6、s3、以氮转化速率和脱氢酶活性为受试终点开展微生物毒性测试；
7、s4、根据氮转化速率抑制率nir和脱氢酶活性抑制率dir评估待评估土壤的生态风险：
8、当nir<10％时，待评估土壤生态风险低，可直接生态利用；
9、当dir≥10％时，待评估土壤生态风险高，不可开展生态利用；
10、当nir≥10％且dir<10％时，待评估土壤生态风险中等，进行生态修复后可有限的开展生态利用。
11、步骤s1中污染调查包括苯并[a]芘浓度检测和土壤性质调查；若待评估土壤中苯并[a]芘浓度>0mg/kg，则进行步骤s2；否则评估终止，待评估土壤生态风险低。
12、本发明步骤s1中污染调查的目的是为了判断待评估土壤是否存在苯并[a]芘污染，不影响本发明对苯并[a]芘污染的待评估土壤的评估结果，故对苯并[a]芘浓度检测方法和土壤性质调查方法不做具体的限定，采用本领域公知方法即可。
13、步骤s2中，
14、待评估土壤根据《土壤环境监测技术规范》(hj/t166)进行采集，并于洁净的具塞磨口棕色玻璃瓶中保存，运送至实验室后，将样品放在搪瓷盘或不锈钢盘上，混匀，除去枝棒、叶片、石子等异物，采用四分法进行粗分。
15、步骤s3中，
16、以氮转化速率为受试终点开展微生物毒性测试方法为：将待评估土壤/对照土壤置于离心管中，培养后加入氯化钾溶液，振荡，静置，离心，取上清液测定硝酸盐含量。
17、步骤s4中，
18、nir的计算公式如下：
19、
20、其中，n0表示对照土壤的上清液硝酸盐含量，mg/kg；ni表示待评估土壤的上清液硝酸盐含量，mg/kg；nir表示待评估土壤的氮转化速率抑制率，％，对照土壤为与待评估土壤性质接近的洁净土壤。
21、优选地，所述培养的方法为：将待评估土壤/对照土壤于20±2℃的避光条件下，湿度保持为最大持水量的40％-60％，培养14-60d。
22、优选地，所述待评估土壤/对照土壤的取样量为4-6g。
23、优选地，所述待评估土壤/对照土壤与0.1mol/l的氯化钾溶液的质量体积比为1g:3-7ml。
24、优选地，所述振荡条件为：转速为100-200r/min，振荡时间为40-60min。
25、优选地，所述离心条件为：离心力为2000-4000g，离心时间为4-6min。
26、步骤s3中，
27、以脱氢酶活性为受试终点开展微生物毒性测试方法为：将待评估土壤/对照土壤置于离心管中，加入2，3，5-三苯基四氮唑氯化物溶液和三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，振荡，孵化，萃取，离心，取上清液通过分光光度计在485nm波长下以三苯基甲酸(tpf)标准曲线测定脱氢酶活性。
28、步骤s4中，
29、dir的计算如下：
30、
31、其中，d0表示对照土壤的上清液脱氢酶活性，mg/d/kg；di表示待评估土壤的上清液脱氢酶活性，mg/d/kg；dir表示待评估土壤的脱氢酶抑制率，％。
32、优选地，tpf标准曲线建立方法为：将tpf原液用乙醇稀释配置成0、11、22、55、110nmol/ml，通过分光光度计在485nm波长处进行测定，其中以仅加入1ml底物溶液(1g 2，3，5-三苯基四氮唑氯化物，80g/mol)溶于10ml三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(100mmol/l ph＝7.6)中作为空白组，建立标准曲线。
33、tpf标准曲线配置浓度及溶剂添加量如表1所示。
34、表1
35、 tpf(nmol/ml) 0 11 22 55 110 tpf(ml) 0 0.1 0.2 0.5 1 乙醇(ml) 3 2.9 2.8 2.5 2
36、所述待评估土壤/对照土壤的脱氢酶活性计算如下：
37、
38、其中，d0表示对照土壤的上清液脱氢酶活性，mg/d/kg；di表示待评估土壤的上清液脱氢酶活性，mg/d/kg；cs表示待评估土壤上清液tpf浓度，nmol/ml；cb表示空白组中tpf浓度，nmol/ml；v表示反应液体积，ml；m表示土壤质量，g；dm表示土壤样品干重占比，％；rt表示反应时间，min。
39、优选地，在测试脱氢酶活性之前，将待评估土壤/对照土壤于4±2℃条件下保存7d。
40、优选地，所述待评估土壤/对照土壤与30mmol/l的2，3，5-三苯基四氮唑氯化物溶液的质量体积比为1g:0.1-0.3ml。
41、优选地，所述待评估土壤/对照土壤与100mmol/lph＝7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液的质量体积比为1g:0.5-1ml。
42、优选地，所述振荡条件为：转速为100-200r/min，振荡时间为5-15s。
43、优选地，所述孵化条件为：温度为25±1℃，时间为5-7h。
44、优选地，所述萃取方法为：向孵化后的离心管中加入20-30ml的无水乙醇，在25±1℃、200-300r/min的转速下进行避光萃取0.5-1.5h。
45、优选地，所述离心条件为：离心力为1000-3000g，离心温度为20±2℃，离心时间为4-6min。
46、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
47、1、本发明解决了采用物种敏感性分布法在毒理学数据缺失情况下无法开展土壤生态风险评估的问题，避免了评估因子法在评估过程中评估人员主观确定评估因子时引入的人为误差。
48、2、本发明方法直接采用待评估土壤进行实测，因此无需担心土壤性质的差异会对苯并[a]芘的毒性效应有影响。
49、3、本发明的活性指标氮转化速率和脱氢酶均为微生物主导的过程，相比于采用植物进行毒理学实验来说，培养时间大大降低，相比于采用无脊椎动物开展毒理学实验来说，所需土壤样品量大大降低，进而降低了实验的难度，提高了该方法在应用过程中的实操性。
1.一种基于微生物毒性测试评估苯并[a]芘的土壤生态风险的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中污染调查包括苯并[a]芘浓度检测和土壤性质调查；若待评估土壤中苯并[a]芘浓度>0mg/kg，则进行步骤s2；否则评估终止，待评估土壤生态风险低，可直接生态利用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s3中，以氮转化速率为受试终点开展微生物毒性测试方法为：将待评估土壤/对照土壤置于离心管中，培养后加入氯化钾溶液，振荡，静置，离心，取上清液测定硝酸盐含量。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤s4中，nir的计算公式如下：
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养的方法为：将待评估土壤/对照土壤于20±2℃的避光条件下，湿度保持为最大持水量的40％-60％，培养14-60d。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s3中，以脱氢酶活性为受试终点开展微生物毒性测试方法为：将待评估土壤/对照土壤置于离心管中，加入2，3，5-三苯基四氮唑氯化物溶液和三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，振荡，孵化，萃取，离心，取上清液通过分光光度计在485nm波长下以tpf标准曲线测定脱氢酶活性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤s4中，dir的计算如下：
8.根据权利要求6所述的方法，所述待评估土壤/对照土壤与30mmol/l的2，3，5-三苯基四氮唑氯化物溶液的质量体积比为1g:0.1-0.3ml；所述待评估土壤/对照土壤与100mmol/lph＝7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液的质量体积比为1g:0.5-1ml。
9.根据权利要求6所述的方法，所述孵化条件为：温度为25±1℃，时间为5-7h。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述萃取方法为：向孵化后的离心管中加入20-30ml的无水乙醇，在25±1℃、200-300r/min的转速下进行避光萃取0.5-1.5h。
