本发明属于药物筛选，具体涉及一种靶点的原位筛选方法和试剂盒。
背景技术：
1、dna编码化合物库(dna-encoded library，简称del)技术是一种高效的小分子药物筛选技术，利用dna序列对化合物结构进行编码，能够在同一体系中用靶标对不同化合物同时进行筛选，极大节省了筛选的成本。在与pcr扩增和dna测序技术结合后，del技术已经达成了亿级容量的化合物库的筛选。与传统的高通量筛选相比，del经济、省时，在化合物库规模以及筛选成本上都有巨大优势。
2、目前，通过利用纯蛋白进行del的筛选，已经筛选得到了许多潜在的苗头化合物。然而，由于纯蛋白的性质和天然细胞环境下的蛋白性质存在一定偏差，从纯蛋白筛选得到的苗头化合物无法保证生物学活性，尚需单独进行验证。因此，应用于天然细胞环境下选择性地进行靶标蛋白的del筛选方法亟待开发。
3、不同于纯蛋白的固载筛选，del细胞筛选面临着严峻的考验。细胞表面存在各种复杂的生物学大分子，会与del分子库进行大量的非特异性结合，导致假阳性分子的富集，使得难以从中区分得到真正的目标分子的配体。而解决这一难题正是实现del细胞筛选不可或缺的一步。目前del领域已经发展了一些在细胞上进行特异性靶标筛选的方法并得到了初步的应用，例如gsk公司通过对比目标蛋白过表达细胞和对照细胞的筛选结果来得到特异性靶标的苗头化合物(acs comb sci.2015,17(12),722-731)，krusemark组通过给目标蛋白融合标签来进行筛选(j.am.chem.soc.2019,141,43,17057-17061)，李笑宇课题组对目标蛋白进行了dna标记来引导后续的特异性筛选(nat chem.2021,13(1),77-88)，而hansen组通过显微注射和配体捕获富集(binder trap enrichment，简称bte)的方法从而实现细胞内的筛选(j.am.chem.soc.2021,143,7,2751-2756)。
4、然而，能够在del领域进行细胞筛选的方法开发还远远不足。为此，需要发展一种简单有效的在细胞表面对特定靶标进行del筛选的方法，来扩展del细胞筛选这一亟待开发的领域。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶点的原位筛选方法，以解决现有方法所存在的以上问题。
2、为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
3、第一方面，本发明提供了一种靶点的原位筛选方法，包括：
4、提供靶标蛋白、dna编码化合物库和竞争性配体，所述dna编码化合物库包括目标dna编码化合物，所述靶标蛋白具有正构位点和/或别构位点，所述竞争性配体能够与所述正构位点和/或所述别构位点特异性结合；
5、将所述靶标蛋白与所述dna编码化合物库进行第一孵育，使得所述目标dna编码化合物与所述正构位点和/或所述别构位点结合，得到第一复合物；
6、将所述第一复合物与所述竞争性配体进行第二孵育，使得所述竞争性配体与所述靶标蛋白结合而将所述目标dna编码化合物置换出来，然后，收集所述目标dna编码化合物；
7、分析所述目标dna编码化合物的dna序列信息，获得所述目标dna编码化合物的化合物结构信息。
8、本发明所提供的以上靶点的原位筛选方法中，先将dna编码化合物库与靶标蛋白进行孵育，形成由目标dna编码化合物与靶标蛋白结合的第一复合物，然后，加入能够与正构位点和/或别构位点特异性结合的竞争性配体，竞争性配体通过与第一复合物中的正构位点或别构位点结合，从而将目标dna编码化合物从第一复合物中置换出来，之后通过目标dna编码化合物的dna序列信息确定特异性结合靶标蛋白的化合物信息，最终实现细胞背景下针对靶标蛋白的del筛选。
9、在一些实施例中，所述竞争性配体与所述正构位点特异性结合，筛选得到的所述目标dna编码化合物的化合物为正构位点药物。
10、进一步实施例中，所述竞争性配体为
11、在一些实施例中，所述竞争性配体能够与所述别构位点特异性结合，筛选得到的所述目标dna编码化合物的化合物为别构位点药物。
12、进一步实施例中，所述竞争性配体为
13、在一些实施例中，所述靶标蛋白为细胞的膜蛋白，所述细胞包括：hek293t细胞、cho-k1细胞、a549细胞中的至少一种；和/或
14、所述靶标蛋白包括β2ar。
15、进一步实施例中，将所述靶标蛋白与所述dna编码化合物库进行第一孵育的步骤中，所述细胞的数量大于或等于106个。如此，以促进目标dna编码化合物能够充分结合靶标蛋白。
16、在一些实施例中，所述竞争性配体与所述目标dna编码化合物的化合物相同或不相同；和/或
17、所述竞争性配体的用量等于或大于所述目标dna编码化合物。
18、通过采用以上靶标蛋白和竞争性配体，保证原本与靶标蛋白结合的目标dna编码化合物能够被竞争性配体置换出来。当竞争性配体与目标dna编码化合物的化合物相同时，一些实施例中，竞争性配体的用量等于或大于所述目标dna编码化合物；当竞争性配体与目标dna编码化合物的化合物互不相同时，一些实施例中，竞争性配体与位点的结合力大于目标dna编码化合物与位点的结合力。如此，保证竞争性配体能够有效置换与位点结合的目标dna编码化合物。
19、在一些实施例中，所述第一孵育包括：在零上低温条件下孵育直至所述目标dna编码化合物结合所述靶标蛋白；和/或
20、所述第二孵育包括：在4℃～37℃下孵育直至所述竞争性配体将所述目标dna编码化合物从所述靶标蛋白上置换出来；和/或
21、所述第一孵育和/或所述第二孵育在缓冲液中进行，所述缓冲液的盐浓度和ph接近所述目标细胞的生理条件。
22、可以理解的是，零上低温条件是指温度大于0℃且小于16℃，如一些具体实施例中，所述第一孵育包括：在4℃下孵育1.5小时。
23、一些具体实施例中，所述第二孵育包括：在20℃-30℃下孵育0.5小时。
24、第一孵育、第二孵育过程中所使用的缓冲液需要对细胞的存活友好，应当为接近生理条件下的盐浓度以及ph的缓冲液。如一些具体实施例中，所述缓冲液为pbs缓冲液。
25、在一些实施例中，收集所述目标dna编码化合物的步骤包括：
26、离心，取上清液；
27、在所述上清液中加入用于沉淀所述目标dna编码化合物的沉淀剂，进行静置处理和/或离心处理，然后进行洗涤。
28、在一些实施例中，所述沉淀剂主要由醋酸盐、糖原和乙醇组成；和/或
29、进行洗涤的步骤采用浓度为70％-75％的乙醇溶液作为洗涤液。
30、沉淀剂主要用于沉淀目标dna编码化合物，主要由醋酸盐、糖原和乙醇组成，醋酸盐、糖原和乙醇的具体组成可根据目标dna编码化合物的特点进行灵活调整。如一些实施例中，400μl的上清液中加入的沉淀剂由9.8mgnaoac、1mg glycogen和1000μl etoh组成。
31、在一些实施例中，分析所述目标dna编码化合物的dna序列信息的步骤包括：
32、将所述目标dna编码化合物进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；
33、将所述pcr扩增产物进行dna测序，获得所述目标dna编码化合物的dna序列信息。
34、第二方面，本发明还提供了一种试剂盒，应用于dna编码化合物库的细胞筛选，所述试剂盒包括：靶标蛋白、dna编码化合物库和竞争性配体；所述dna编码化合物库包括目标dna编码化合物，所述靶标蛋白具有正构位点和/或别构位点，所述竞争性配体能够与所述正构位点和/或所述别构位点特异性结合；
35、其中，所述dna编码化合物库的细胞筛选采用上述筛选方法。
36、本发明所提供的试剂盒，主要由靶标蛋白、dna编码化合物库和竞争性配体组成，通过采用上述筛选方法，可应用于dna编码化合物库的细胞筛选，最终实现细胞背景下针对靶标蛋白的del筛选。
37、第三方面，本发明还提供了一种试剂盒，包括靶标蛋白、dna编码化合物库和竞争性配体；所述靶标蛋白为hek293t细胞、cho-k1细胞或a549细胞的膜蛋白β2ar，具有正构位点和/或别构位点；所述竞争性配体能够与所述正构位点和/或所述别构位点特异性结合；所述dna编码化合物库包括目标dna编码化合物。
38、在一些实施例中，所述试剂盒中的所述竞争性配体为：
39、“靶点的原位筛选方法”是指基于细胞上的靶标蛋白、利用dna编码化合物库筛选化合物的方法。
40、“dna编码化合物库的细胞筛选”是指基于活细胞的利用dna编码化合物库筛选化合物。
41、在利用pcr扩增所选分子的编码dna的实施方案中，该编码dna优选地包括pcr引物序列。例如，在合成的第一循环之前，起始dna中可以包含pcr引物序列，或者可以与第一引入dna一起包含。编码dna在编码序列之后也可以包含加帽pcr引物序列。在文库合成的最后一个循环后，该加帽序列可以与编码dna连接，或者可以包含在最后一个循环的引入dna中。在引入dna包含pcr引物序列的情况中，这些引入dna优选地明显长于在其他循环中添加的引入寡核苷酸，因为它们既包含编码序列也包含pcr引物序列。
42、对于在添加最后的结构单元和最后的引入dna后添加加帽序列的情况，如此处所述的文库的合成包括将加帽序列与编码dna连接的步骤，使基本所有文库成员的dna部分终止于包含pcr引物序列的序列中。适合在本发明的文库中使用的pcr引物序列在本领域中公知；合适的引物和方法例如描述在innis等人，编，pcr protocols：aguide to methods andapplications，san diego：academic press(1990)中，其内容在此全文引用作为参考。优选地，通过与作为最后合成循环的产物的组合组分连接，添加该加帽序列。加帽序列可以用文库构建中使用的酶法添加。
43、如上所述，作为本发明方法一部分的寡核苷酸标签的核苷酸序列可以用聚合酶链反应(pcr)确定。
44、dna标签由标识构成如此处所述功能部分的结构单元的多核苷酸组成。dna标签的核酸序列通过对dna标签进行如下pcr反应来测定。适当样品与pcr引物对接触，该引物对的每个成员具有预先选择的核苷酸序列。该pcr引物对通过与编码dna标签上的pcr引物结合部位杂交，能够启动引物延伸反应。该pcr引物结合部位优选地设计在编码dna标签内部。例如，pcr引物结合部位可以掺入起始dna标签内，而第二pcr引物结合部位可以位于最终dna标签内。或者，第二pcr引物结合部位可以掺入如此处所述的加帽序列中。在优选实施方案中，该pcr引物结合部位的长度至少为约5、7、10、13、15、17、20、22或25个核苷酸。
45、通过将pcr引物对，优选预定量的该引物对，与编码dna标签的核酸，优选预定量的该核酸，在pcr缓冲液中混合，形成pcr反应混合物，进行pcr反应。将该混合物热循环一定的循环数，该循环数一般预先确定，足以形成pcr反应产物。足够量的产物是能够以足以进行dna序列测定的量分离的产物。
46、pcr一般通过热循环进行，即在一个温度范围内重复地提高和降低pcr反应混合物的温度，该范围的下限为约30℃至约55℃，上限为约90℃至约100℃。提高和降低可以是连续的，但优选是阶段的，在有利于多核苷酸合成、变性和杂交的各个温度下具有相对温度稳定的时间段。
47、pcr反应用任何适当的方法进行。通常在缓冲的水溶液即pcr缓冲液中发生，优选为ph7-9。优选含有摩尔过量的引物。为了提高该方法的效率，优选较大的摩尔过量。
48、本发明使用的术语“引物”是指从核酸限制性消化物中纯化的或合成产生的多核苷酸，当置于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时，即在核苷酸和聚合试剂如dna聚合酶、逆转录酶等的存在下，以及在合适的温度和ph下，它能够作为核酸合成的起点。为了效率最高，引物优选是单链，但是也可以是双链形式。如果是双链，则在用来制备延伸产物之前首先处理该引物，使它与互补链分开。优选地，引物是一种聚脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长，以在聚合试剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度和引物来源。
49、此处所用的引物选择为与所要扩增的每个特定序列的不同链“基本”互补。意思是引物必须充分互补，以便与相应的模板链非随机地杂交。因此，引物序列可能反映或者可能不反映模板的准确序列。
50、多核苷酸引物可以用任何合适的方法制备，例如narang等人，(1979)meth.enzymol.，68：90；美国专利号4,356,270，美国专利号4,458,066，美国专利号4,416,988，美国专利号4,293,652；和brown等人，(1979)meth.enzymol.，68：109所述的磷酸三酯或磷酸二酯法。上述所有文献的内容在此引用作为参考。
51、一旦扩增出编码dna标签，即可应用核酸序列分析确定该标签的序列，并最终确定选择的分子的组成，核酸序列分析是用于测定核苷酸序列的众所周知的方法。核酸序列分析通过以下方法的组合进行：(a)基于探针链与其互补靶标杂交或变性的生理化学技术，和(b)与聚合酶的酶反应。
1.一种靶点的原位筛选方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的原位筛选方法，其特征在于，所述竞争性配体与所述正构位点特异性结合，筛选得到的所述目标dna编码化合物的化合物为正构位点药物；
3.根据权利要求1所述的原位筛选方法，其特征在于，所述竞争性配体能够与所述别构位点特异性结合，筛选得到的所述目标dna编码化合物的化合物为别构位点药物；
4.根据权利要求1至3任一项所述的原位筛选方法，其特征在于，所述靶标蛋白为细胞的膜蛋白，所述细胞包括：hek293t细胞、cho-k1细胞、a549细胞中的至少一种；和/或
5.根据权利要求4所述的原位筛选方法，其特征在于，将所述靶标蛋白与所述dna编码化合物库进行第一孵育的步骤中，所述细胞的数量大于或等于106个。
6.根据权利要求1至3任一项所述的原位筛选方法，其特征在于，所述竞争性配体与所述目标dna编码化合物的化合物相同或不相同；和/或
7.根据权利要求1至3任一项所述的原位筛选方法，其特征在于，所述第一孵育包括：在零上低温条件下孵育直至所述目标dna编码化合物结合所述靶标蛋白；和/或
8.一种试剂盒，其特征在于，应用于dna编码化合物库的细胞筛选，所述试剂盒包括：靶标蛋白、dna编码化合物库和竞争性配体；所述dna编码化合物库包括目标dna编码化合物，所述靶标蛋白具有正构位点和/或别构位点，所述竞争性配体能够与所述正构位点和/或所述别构位点特异性结合；
9.一种试剂盒，其特征在于，包括靶标蛋白、dna编码化合物库和竞争性配体；所述靶标蛋白为hek293t细胞、cho-k1细胞或a549细胞的膜蛋白β2ar，具有正构位点和/或别构位点；所述竞争性配体能够与所述正构位点和/或所述别构位点特异性结合；所述dna编码化合物库包括目标dna编码化合物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述竞争性配体为：
