本发明属于生物化学，具体涉及蜂蜜中花粉dna的提取纯化方法。
背景技术：
1、蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。蜂蜜中含有多种糖，主要是果糖和葡萄糖。此外，还含有有机酸、酶和固体颗粒物如植物花粉等。由于蜂蜜市价较高，市场需求量大，有一些不法商贩以假乱真、以次充好，严重地损害了消费者利益，因此急需建立蜂蜜产品的鉴别评价体系。
2、蜂蜜成分比较复杂，其中75％的成分为糖类，同时还含有多种酶、氨基酸、无机盐物质，对dna提取及后续检测影响较大，所以必须改进，寻找更优化的蜂蜜中花粉dna的提取纯化方法。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供蜂蜜中花粉dna的提取纯化方法，用于解决现有技术中问题。
2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
3、本发明提供一种蜂蜜中花粉dna的提取纯化方法，包括以下步骤：
4、步骤(1)取20ml蜂蜜，加入10ml水，颠倒孵育，充分混匀后，取15ml蜂蜜水溶液与20ml无水乙醇充分混合，静置，离心，去除上清液，得到花粉沉淀；
5、步骤(2)将1.0ml预热至65℃的ctab提取缓冲液加入沉淀中，充分悬浮，混匀，吸取2ml混匀液，加入蛋白酶k，颠倒孵育，得到孵育产物；
6、步骤(3)将孵育产物离心，取900μl上清液加入600μl氯仿中，再次离心；
7、步骤(4)取上清液加入500μl异丙醇中，静置后，离心，去除上清液，得到在沉淀中加入500μl乙醇溶液，再次离心；
8、步骤(5)去除上清液，干燥沉淀，再加入50μl预热到65℃的超纯水，温浴，离心，得到上清液即为蜂蜜的dna。
9、优选地，所述步骤(1)中，颠倒孵育方法：在55℃下杂交炉颠倒孵育10min；静置方法：在-20℃下静置20min；离心条件：离心转速为8000rpm、离心时间为10min。
10、优选地，所述步骤(2)中，ctab提取缓冲液具体为：2.5mol/lnacl，2％ctab，100mmol/l tris-hcl溶液ph8.0,50mmol/l edta，ph至7.5。
11、优选地，所述步骤(2)中，蛋白酶k的用量为40μl；蛋白酶k的密度为20mg/ml；颠倒孵育方法：在65℃下杂交炉颠倒孵育2h。
12、优选地，所述步骤(3)中，离心方法：以13000rpm的转速离心10min；再次离心方法：以13000rpm的转速再次离心10min。
13、优选地，所述步骤(4)中，静置方法：在4℃下静置12-18h；离心方法：以13000rpm的转速离心10min。
14、优选地，所述步骤(4)中，乙醇水溶液为75％的乙醇溶液；再次离心方法：以13000rpm的转速再次离心5min。
15、优选地，所述步骤(5)中，干燥沉淀方法：敞口放置在50℃下的金属浴上干燥沉淀；温浴方法：在65℃下金属浴上温浴5min；离心方法：以12000rpm的转速离心1min。
16、综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
17、1.此实验方法操作简单，能有效提取市场上常见蜜种的蜂蜜dna，可以应用于后期蜂蜜的转基因检测，蜜源检测等。
18、2.本发明方法采用了10ml的蜂蜜进行提取，先制成蜂蜜水溶液，再与无水乙醇混合，在-20℃下保存后离心，能最大限度的获得蜂蜜中的花粉，再用ctab裂解液溶解细胞膜，在高盐溶液中溶解，采用氯仿进一步去除蛋白质、多糖、酚类等杂质，异丙醇在低温下沉淀dna，过夜可以加大dna的富集量，75％的乙醇进一步沉淀dna，最后用纯水洗涤获得蜂蜜中的花粉dna；蜂蜜的花粉dna含量低，本发明方法操作步骤简单，无需特殊的仪器和试剂，对市面上常见的蜂蜜进行提取，od值和dna浓度均符合pcr的要求，内标基因的ct值均小于25，pcr的结果进一步验证了此方法的有效，能完全应用于更近一步的蜜源种类筛查及转基因的检测。
1.一种蜂蜜中花粉dna的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的蜂蜜中花粉dna的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中，颠倒孵育方法：在55℃下杂交炉颠倒孵育10min；静置方法：在-20℃下静置20min；离心条件：离心转速为8000rpm、离心时间为10min。
3.根据权利要求1所述的蜂蜜中花粉dna的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，ctab提取缓冲液具体为：2.5mol/lnacl，2％ctab，100mmol/ltris-hcl溶液ph8.0,50mmol/l edta，ph至7.5。
4.根据权利要求1所述的蜂蜜中花粉dna的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，蛋白酶k的用量为40μl；蛋白酶k的密度为20mg/ml；颠倒孵育方法：在65℃下杂交炉颠倒孵育2h。
5.根据权利要求1所述的蜂蜜中花粉dna的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)中，离心方法：以13000rpm的转速离心10min；再次离心方法：以13000rpm的转速再次离心10min。
6.根据权利要求1所述的蜂蜜中花粉dna的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤(4)中，静置方法：在4℃下静置12-18h；离心方法：以13000rpm的转速离心10min。
7.根据权利要求1所述的蜂蜜中花粉dna的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤(4)中，乙醇水溶液为75％的乙醇溶液；再次离心方法：以13000rpm的转速再次离心5min。
8.根据权利要求1所述的蜂蜜中花粉dna的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤(5)中，干燥沉淀方法：敞口放置在50℃下的金属浴上干燥沉淀；温浴方法：在65℃下金属浴上温浴5min；离心方法：以12000rpm的转速离心1min。
