本发明属于细胞工程，具体涉及胚胎和胚胎外干细胞的衍生培养方法。
背景技术：
1、精确的胚胎发生需要胚胎和胚胎外组织之间的精确协调。虽然一些哺乳动物物种已经产生了来自胚胎和胚胎外起源的干细胞，但它们生长在不同的培养条件下，具有不同的培养基组成，这使得研究跨谱系通信变得困难。因此，制定建立胚胎和胚胎外干细胞共培养的培养条件是必要的，以解剖早期哺乳动物发育过程中的谱系串扰。这种胚胎干细胞和胚胎外干细胞的共培养可以应用于揭示一些保守的和以前未被识别的多能性细胞的生长和信号通路。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供胚胎和胚胎外干细胞的衍生培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、胚胎和胚胎外干细胞的衍生培养方法，包括以下步骤：
4、s1、获取生殖细胞或幼稚多能干细胞pscs；
5、s2、在包含成纤维细胞生长因子fgf激活剂、转化生长因子tgf-β激活剂和wnt激活剂的培养基中培养生殖细胞或幼稚多能干细胞pscs；
6、s3、从细胞生长过程中分离出外胚层样细胞、内胚层养细胞和滋养层养细胞，培养和传代分离的细胞；
7、s4、获取稳定的体外衍生胚胎干细胞escs、胚胎外内胚层干细胞xens和滋养细胞干细胞tscs。
8、优选的，所述s1中生殖细胞取自人类、啮齿动物或非人类灵长类动物，优选取用哺乳动物，优先取用囊胚。
9、一种限制escs在细胞培养中生长的方法，应用于胚胎和胚胎外干细胞的衍生培养方法，具体包括以下步骤：
10、s5，从生殖细胞或幼稚多能干细胞pscs中获得一个escs群体；
11、s6，在包含成纤维细胞生长因子fgf激活子、转化生长因子tgf-β激活子和wnt激活子的培养基中培养escs；
12、s7，在培养基中添加生长限制剂，所述生长限制剂选用层粘连蛋白、胶原蛋白、xens中的一种或者多种组合；
13、s8，在培养基中维持培养细胞至少5天，获得生长受限的escs群体。
14、优选的，选用层粘连蛋白作为生长限制剂时，层粘连蛋白在培养基中的浓度为1-200μg/ml，选用胶原蛋白作为生长限制剂时，胶原蛋白在培养基中的浓度为1-200μg/ml，选用xens作为生长限制剂时，将xens以初始esc：xen＝1:2～8:1的比例添加到培养基中。
15、一种在共享细胞培养条件下获得多谱系干细胞的方法，应用胚胎和胚胎外干细胞的衍生培养方法，具体包括以下步骤：
16、s9、从生殖细胞或pscs中获得一个escs群体、xens群体和tscs群体；
17、s10、在包含成纤维细胞生长因子fgf激活子、转化生长因子tgf-β激活子和wnt激活子的培养基中共培养escs、xens和tscs；
18、s11、在培养基中保持培养混合细胞至少5天，获得多谱系干细胞群体。
19、优选的，所述s11中的多谱系干细胞群体包括escs和xens细胞组合、escs和tscs细胞组合及escs、xens和tscs细胞组合。
20、优选的，所述s10中，在培养基中添加浓度为1—200μg/ml的胶原蛋白或层粘连蛋白，所述s10中，esc与xen以1:2-8:1的方式组合escs和xens，esc与tsc以1:2-8:1的方式组合escs和tscs，esc、xen与tsc以1：1：1的方式组合escs、xens和tscs。
21、优选的，所述培养基包括神经基础培养基、所述fgf激活剂选用fgf2，所述tgf-β激活剂是activin-a，所述wnt激活剂是gsk3抑制剂，所述gsk3抑制剂是chir99021。
22、一种体外公共培养系统，包括：
23、escs，取自囊胚，所述escs中有一个或多个整合素基因的突变或缺失；
24、xens，取自囊胚，所述xens在一个或多个层粘连蛋白基因中有突变或缺失；
25、培养基，由成纤维细胞生长因子fgf激活剂、转化生长因子tgf-β激活剂和wnt激活剂组成。
26、一种细胞分析方法，应用于胚胎和胚胎外干细胞的衍生培养方法、一种限制escs在细胞培养中生长的方法和一种在共享细胞培养条件下获得多谱系干细胞的方法，包括药物评估、毒性评估、细胞生长评估、细胞增殖评估、细胞分化评估、组织发育评估、细胞培养评估中的一种或者多种的任何组合。
27、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
28、本发明提供了一种在体外获得胚胎干细胞ecss、胚胎外胚内胚层干细胞xens和滋养细胞干细胞tscs的方法，能够获得生殖细胞或幼稚多能干细胞pscs，将生殖细胞或者幼稚多能干细胞pscs置于包括fgf因子、成纤维生长因子tgf-β激活剂和wnt激活剂的培养基中进行培养，能够获得稳定的escs、xens和tscs，通过胚胎干细胞和胚胎外干细胞的共培养，应用于揭示一些保守的和以前未被识别的多能性细胞的生长和信号通路。
1.胚胎和胚胎外干细胞的衍生培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的胚胎和胚胎外干细胞的衍生培养方法，其特征在于：所述s1中生殖细胞取自人类、啮齿动物或非人类灵长类动物，优选取用哺乳动物，优先取用囊胚。
3.一种限制escs在细胞培养中生长的方法，应用于权利要求1-2任一项所述的胚胎和胚胎外干细胞的衍生培养方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种限制escs在细胞培养中生长的方法，其特征在于：选用层粘连蛋白作为生长限制剂时，层粘连蛋白在培养基中的浓度为1-200μg/ml，选用胶原蛋白作为生长限制剂时，胶原蛋白在培养基中的浓度为1-200μg/ml，选用xens作为生长限制剂时，将xens以初始esc：xen＝1:2～8:1的比例添加到培养基中。
5.一种在共享细胞培养条件下获得多谱系干细胞的方法，应用权利要求1-2任一项所述的胚胎和胚胎外干细胞的衍生培养方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种在共享细胞培养条件下获得多谱系干细胞的方法，其特征在于：所述s11中的多谱系干细胞群体包括escs和xens细胞组合、escs和tscs细胞组合及escs、xens和tscs细胞组合。
7.根据权利要求6所述的一种在共享细胞培养条件下获得多谱系干细胞的方法，其特征在于：所述s10中，在培养基中添加浓度为1—200μg/ml的胶原蛋白或层粘连蛋白，所述s10中，esc与xen以1:2-8:1的方式组合escs和xens，esc与tsc以1:2-8:1的方式组合escs和tscs，esc、xen与tsc以1：1：1的方式组合escs、xens和tscs。
8.根据权利要求7所述的一种在共享细胞培养条件下获得多谱系干细胞的方法，其特征在于：所述培养基包括神经基础培养基、所述fgf激活剂选用fgf2，所述tgf-β激活剂是activin-a，所述wnt激活剂是gsk3抑制剂，所述gsk3抑制剂是chir99021。
9.一种体外公共培养系统，其特征在于，包括：
10.一种细胞分析方法，应用于权利要求1-2任一项所述的胚胎和胚胎外干细胞的衍生培养方法、权利要求3-4任一项所述的一种限制escs在细胞培养中生长的方法和权利要求5-8任一项所述的一种在共享细胞培养条件下获得多谱系干细胞的方法，其特征在于：包括药物评估、毒性评估、细胞生长评估、细胞增殖评估、细胞分化评估、组织发育评估、细胞培养评估中的一种或者多种的任何组合。
