本发明属于植物栽培，具体涉及一种越南山龙眼再生体系的构建方法。
背景技术：
1、越南山龙眼(helicia cochinchinensis)又叫红叶树、羊屎果、小叶山龙眼，系山龙眼科山龙眼属常绿乔木或小乔木，高4～20米，总状花序腋生，花白色至淡黄色，花期6～10月，果期11月至翌年3月；分布于广东、广西等长江流域以南各地，越南、日本也有分布。越南山龙眼具有较高的药用价值，不仅有镇静止痛作用，还具有收敛解毒、活血祛瘀之功效；此外，越南山龙眼还是一种优良的木材树种与园林树种，其适应性和抗逆性极强，树形挺拔笔直，树姿优美，枝叶浓密，临冬串串黑果缀于枝头，远望如同满树缀满黑玛瑙，更由于其具有较强的抗性，十分适合作为南方沿海风景林以及城市环境保护林的配景树。
2、目前，越南山龙眼繁殖通常采用播种或扦插两种方式，扦插苗主干不明显，且扦插成活率较低，生根率最高仅有23.5％(徐斌芬,王国明,柴雪芹等.红叶树繁育技术试验[j].浙江林业科技,2005(5)：39-41.)。越南山龙眼也可通过种子繁殖，但种子发芽率低，实生苗表型性状分化大，参差不齐，进而影响到生态造林和园林景观的质量与效益。通过组培微枝扦插技术，控制培养条件，可降低外界环境对植株生长的影响，缩短培养周期，有效加快林木种苗产业化和林木良种化的过程。而关于越南山龙眼的组培再生技术尚未见报道。因此，针对越南山龙眼种苗繁育所存在的诸多问题，构建一种高效的再生体系对越南山龙眼种苗生产具有十分重要的意义。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题在于如何在保持越南山龙眼母本植株的优良表型一致性与高遗传稳定性的同时，在短期内大量生产优良无性系苗木。
2、本发明采取的技术方案如下：
3、一种越南山龙眼再生体系的构建方法，包括以下步骤：
4、s1：采用优树枝条嫁接实生苗获得越南山龙眼茎段试验材料，以半木质化带腋芽茎段为外植体，经消毒后接种于诱导培养基中进行腋芽诱导；
5、s2：将步骤s1中诱导出的腋芽切成1.2～1.5cm带芽茎段，通过微枝扦插方式转接于继代培养基中进行增殖和伸长培养；
6、s3：将步骤s2中的增殖芽切成1.5～2.0cm带芽茎段，通过微枝扦插方式转接于生根培养基中进行生根培养，获得完整的越南山龙眼再生植株。
7、s4：将步骤s3中的组培苗生根培养20d后，移到温室进行炼苗5～7d，使其渐渐适应室外自然环境。移栽前一天，将培养瓶松开，之后将组培生根苗取出，洗净植株上粘附的培养基，移栽至经消毒处理的轻型基质(v泥炭土：v珍珠岩＝3:1)中，浇透水，移苗后适当遮荫，定时透气，15d后移开覆盖物进行水肥常规管理。
8、优选地，步骤s1中外植体获得步骤具体为：采集越南山龙眼优良单株饱含芽点的健壮枝条作为接穗，嫁接于温室大棚中1年生越南山龙眼实生苗砧木上，经过半年的栽培管理，待嫁接苗长出新枝条后，剪取健壮的半木质化枝条为外植体试验材料(即幼化处理后的枝条)。
9、优选地，步骤s1中所述消毒处理具体为：剪去外植体叶片与叶柄，放入盛有5％洗洁精溶液的不锈钢盘内，用软毛笔清洗枝条，之后用自来水冲洗10min，将冲洗好的外植体放在超净工作台上，先用75％乙醇消毒10s，随后用无菌水清洗三次，再将茎段放入0.1％的升汞中消毒5～10min，最后再用无菌水清洗3～5次，备用。
10、优选地，步骤s1中所述诱导处理及诱导培养基具体为：将灭菌好的外植体切成1.5～2.0cm的带芽茎段，快速接种到诱导培养基上进行诱导培养；所述诱导培养基为ms+0.5～2.0mg/l 6-ba+0.1mg/l naa+0.5～1.0mg/l ga3+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉，ph为5.8～6.0。
11、优选地，步骤s2中所述继代培养基具体为：1/2ms+0.1～0.3mg/l 6-ba+0.01～0.05mg/lnaa+0.5mg/l ga3+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉，ph为5.8～6.0。
12、优选地，步骤s2与s3中所述微枝扦插方式具体为：在增殖与生根阶段，切取越南山龙眼单芽或单节带芽茎段直接扦插于培养基中进行增殖与生根培养。
13、优选地，步骤s3中所述生根培养基为：1/2ms+0.25～0.5mg/l iba+0.25～0.5mg/lnaa+15g/l蔗糖+6g/l琼脂粉，ph为5.8～6.0。
14、优选地，步骤s1～s3中所述培养条件具体为：接种好的试验材料置于无菌培养室进行培养，培养温度为25±2℃，以日光灯为光源，光照强度为1500～2000lx，光照时间12h/d。
15、优选地，步骤s4中所述轻型基质组成为：v泥炭土：v珍珠岩＝3:1。
16、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
17、(1)本发明采用了优树枝条嫁接实生苗方式与温室大棚栽培方式获得外植体试验材料，有效地实现了外植体的幼化处理，且在一定程度上极大减少了外植体带菌量及带菌几率，为越南山龙眼无菌系的建立打下良好的基础。
18、(2)本发明以半木质茎段为外植体，通过微型扦插技术实现了植株的离体再生，进而构建了一种高效的越南山龙眼再生体系。在继代培养阶段，虽然较高浓度的激素配比能够诱导出较多不定芽，但是不定芽基部愈伤严重，且叶片呈现严重玻璃化，生长状态较差，不利于进一步的增殖扩繁与生根诱导；而较低的激素配比与ga3能够起到很好的协同作用，虽然增殖芽数量少，但是芽高生长旺盛，叶片舒展，能够将增殖芽分切成2～3段，然后采用微枝扦插方式进行扩繁，同样有效实现了高效扩繁的效果。
19、(3)本发明方法具有繁殖效率高、表型一致性高、遗传稳定性好等优点，极大地缩短了越南山龙眼种苗的生产周期，减少种苗变异风险，为生态造林和园林绿化提供优质的种苗。
1.一种越南山龙眼再生体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种越南山龙眼再生体系的构建方法，其特征在于步骤s1中所述外植体采用以下方式获得：采集越南山龙眼优良单株饱含芽点的健壮枝条作为接穗，嫁接于温室大棚中1年生越南山龙眼实生苗砧木上，经过半年的栽培管理，待嫁接苗长出新枝条后，即可作为外植体试验材料(即幼化处理后的枝条)。
3.根据权利要求1所述的一种越南山龙眼再生体系的构建方法，其特征在于步骤s1中所述消毒处理具体为：剪去外植体叶片与叶柄，放入盛有5％洗洁精溶液的不锈钢盘内，用软毛笔清洗枝条，之后用自来水冲洗10min，将冲洗好的外植体放在超净工作台上，先用75％乙醇消毒10s，随后用无菌水清洗三次，再将茎段放入0.1％的升汞中消毒5～10min，最后再用无菌水清洗3～5次，备用。
4.根据权利要求1所述的一种越南山龙眼再生体系的构建方法，其特征在于步骤s1中所述诱导处理及诱导培养基具体为：将灭菌好的外植体切成1.5～2.0cm的带芽茎段，快速接种到诱导培养基上进行诱导培养；所述诱导培养基为ms+0.5～2.0mg/l 6-ba+0.1mg/lnaa+0.5～1.0mg/lga3+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉，ph为5.8～6.0。
5.根据权利要求1所述的一种越南山龙眼再生体系的构建方法，其特征在于步骤s2中所述继代培养基具体为：1/2ms+0.1～0.3mg/l 6-ba+0.01～0.05mg/lnaa+0.5mg/l ga3+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉，ph为5.8～6.0。
6.根据权利要求1所述的一种越南山龙眼再生体系的构建方法，其特征在于步骤s2中所述微枝扦插方式具体为：在增殖阶段，切取1.2～1.5cm越南山龙眼单芽或单节带芽茎段直接扦插于培养基中进行增殖培养。
7.根据权利要求1所述的一种越南山龙眼再生体系的构建方法，其特征在于步骤s3中所述微枝扦插方式具体为：在生根阶段，切取1.5～2.0cm越南山龙眼单芽或单节带芽茎段直接扦插于培养基中进行生根培养。
8.根据权利要求1所述的一种越南山龙眼再生体系的构建方法，其特征在于步骤s3中所述生根培养基为：1/2ms+0.25～0.5mg/l iba+0.25～0.5mg/lnaa+15g/l蔗糖+6g/l琼脂粉，ph为5.8～6.0。
9.根据权利要求1所述的一种越南山龙眼再生体系的构建方法，其特征在于步骤s1～s3中培养条件均为：接种好的试验材料置于无菌培养室进行培养，培养温度为25±2℃，以日光灯为光源，光照强度为1500～2000lx，光照时间12h/d。
10.根据权利要求1所述的一种越南山龙眼再生体系的构建方法，其特征在于步骤s4中所述轻型基质组成为：v泥炭土：v珍珠岩＝3:1。
