本发明涉及一种新型一锅法催化生产胞苷酸的方法及应用，属于生物。
背景技术：
1、胞苷5’-单磷酸(简称5’-cmp)属于胞嘧啶核苷酸的一种，是rna的结构成分之一。5’-cmp应用于不同的领域，它可作为药物合成的前体或中间体应用于医药领域，也可作为食品营养强化剂应用于食品领域，是一种重要的核苷酸。在食品领域，5’-cmp是一种重要的增鲜剂，可以添加到味精等调味品中，提高食品的鲜味，在节约粮食方面具有重大意义；在医药领域，5’-cmp在生物医药行业中是合成核苷酸药物的关键中间体，在核苷酸药物中，例如三磷酸胞苷、胞嘧啶β-d-呋喃阿拉伯糖苷、二磷酸胞嘧啶胆碱和聚肌苷酸-聚胞苷酸等的生产都需要5’-cmp作中间体。在人体和哺乳动物的免疫系统中，5’-cmp发挥重要作用。研究表明，添加5’-cmp的婴幼儿奶粉的功效更接近母乳，与未添加5’-cmp婴幼儿奶粉相比，能够明显提高婴幼儿的免疫力。
2、目前，生产5’-cmp的方法主要包括：酵母核酸水解法、化学合成法、酶合成法和生物发酵法。酵母核酸水解法传统方法利用rna制备5’-cmp，包括核酸化学水解法和利用核酸水解酶水解法。常用的核酸水解酶是5’-磷酸二酯酶，利用5’-磷酸二酯酶(5’-pde)水解酵母rna制备风味核苷酸和其他具有医用价值的核苷酸，再经离子交换法分离获得相应的核苷单磷酸盐。化学水解法是将酵母rna在强酸溶液(硫酸或硝酸)中脱氨制备胞苷酸或尿苷酸。核酸水解法在原材料来源和反应条件等方面具有较大优势，但该方法存在反应时间长，水解后得到的四种核苷酸混合物分离工序复杂，且成本高等问题。化学合成法主要是利用甲基化的核苷与磷酸或者焦磷酸发生磷酸化反应，如利用2’,3’-异丙基亚甲基核苷与磷酰氯发生磷酸化反应，合成5’-核苷酸，在反应前加入少量水，可大大提高核苷酸的产率。另外，用三烷基磷酸酯替代磷酰氯，和核苷发生磷酸化反应也可以获得相应的核苷酸产物。化学合成法所需试剂成本高，反应后的废水对环境存在污染。
3、前期调研中，关于5’-cmp下游代谢产物胞苷的微生物生产方面的研究较多，但对于5’-cmp的微生物生产研究较少。微生物中有两种途径来合成单磷酸胞苷，从头合成途径和嘧啶补救途径。嘧啶补救途径是细胞直接从外部环境吸收胞嘧啶或者脱氧胞苷三磷酸经转化得到胞苷，胞苷再经尿苷胞苷激酶生成5’-cmp。5’-cmp从头合成途径是以谷氨酰胺、碳酸和atp为原料，在一系列酶的作用下，经过一系列反应，生成ump。在嘧啶核苷酸代谢途径中，ump是合成所有嘧啶核苷酸的前体物质，经过一系列胺化水解反应最终合成5’-cmp。在野生菌株中，5’-cmp的积累量非常低，这是因为5’-cmp属于嘧啶核苷酸代谢产物，嘧啶核苷酸代谢还包括ump、utp、ctp、cdp等，这些物质均是dna或rna的组成物质，具有复杂的调控机制。cn 202111280840.4和cn 202311080425.3分别披露了一种生产5’-胞苷酸的方法，包括基因敲除影响5’-cmp积累的多个基因和过表达促进5’-cmp积累的关键基因，获得可积累5’-cmp的大肠杆菌突变体。但，由于细胞具有复杂的调控机制，同时合成路线偏长，5’-cmp及其前体物容易被胞内的同工酶代谢，需要系统的补料条件实现高密度等条件发酵才能实现5’-cmp的高水平积累，这对于在产业化水平实现其高效生产造成了一定的阻碍作用。
4、尿苷-胞苷激酶是生物体嘧啶核苷酸代谢补救途径中的重要催化剂，它可以使胞苷/尿苷磷酸化生成5’-cmp，但需要ntp为该反应提供磷酸基团。已报道的在大肠杆菌(escherichia coli)、保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricus)和枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)中尿苷和胞苷进行磷酸化反应时，需要gtp为该反应提供磷酸基团，但是gtp的采购成本过高。cn 111269870a披露了一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌及其应用，从胞苷酸生产菌株中克隆得到的胞苷激酶基因，重组菌经破碎后得到的粗酶液有着良好的催化活性和稳定性，加入胞苷、三磷酸腺苷(atp)以及mg2+，反应得到胞苷酸。但，该方法需要大量昂贵的atp，极大的增加了5’-cmp的生产成本。同时，为了减少atp的利用，也有采用乙酸激酶催化乙酰磷酸，实现atp的循环利用。但，乙酰磷酸及其不稳定，而且价格昂贵，对于利用其实现atp循环在工业化生产5’-cmp并不现实。再有，也有采用聚磷酸激酶pkk催化六偏磷酸，实现atp循环(固定化尿苷-胞苷激酶和聚磷酸激酶偶联催化制备5’-胞苷酸,生物工程学报,2020,36(5),1002-1011)。但，由于聚磷酸激酶pkk催化效率偏低且六偏磷酸偏高等，同时，底物胞苷浓度偏低，限制了其在5’-cmp高效催化生产中的应用。
5、因此，亟待研究出一种新的制备方法，以期实现5’-cmp的高效生产。
技术实现思路
1、针对上述现有技术的不足，本发明提供的一种新型一锅法催化生产胞苷酸的方法及应用，目的在于解决现有技术中缺少能够利用廉价原料高效催化生产5’胞苷酸的方法与工艺的技术问题。
2、本发明提供的第一个技术方案为一种一锅法催化生产胞苷酸的方法，所述方法以甲醛、磷酸盐、胞苷为底物，利用磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd、乙酸激酶ack、尿苷胞苷激酶udk作为催化剂组成催化体系，催化合成5’胞苷酸。
3、在某些实施方式中，所述磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd来源于卡斯特兰尼氏菌(castellaniella defragrans)，所述磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd的氨基酸序列如seq idno:4。
4、在某些实施方式中，在所述催化体系中，所述磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd的酶蛋白的添加量为1-50mg/ml。
5、在某些实施方式中，所述乙酸激酶ack来源于保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgaricus)，所述乙酸激酶ack的氨基酸序列如seq id no:5。
6、在某些实施方式中，在所述催化体系中，所述乙酸激酶ack的酶蛋白的添加量为1-50mg/ml。
7、在某些实施方式中，所述尿苷胞苷激酶udk来源于大肠杆菌(escherichia coli)，所述尿苷胞苷激酶udk的氨基酸序列如seq id no:6。
8、在某些实施方式中，在所述催化体系中，所述尿苷胞苷激酶udk的酶蛋白的添加量为1-50mg/ml。
9、在某些实施方式中，所述乙酸激酶ack通过连接肽连接所述磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd组成融合蛋白ack-sa，可选地，所述连接肽为sggsgs、dessaqg、akaaea或aegege。
10、进一步，在所述催化体系中，融合蛋白ack-sa的酶蛋白添加量为1-50mg/ml。
11、在某些实施方式中，在所述催化体系中，所述胞苷的浓度为30～70g/l。
12、在某些实施方式中，在所述催化体系中，所述甲醛的浓度为0.2～0.6m。
13、在某些实施方式中，在所述催化体系中，所述磷酸盐的浓度为0.2～0.6m。
14、进一步，所述磷酸盐包括磷酸钠、磷酸钾。
15、在某些实施方式中，所述催化体系还包含有焦磷酸硫胺素(tpp)和atp。
16、进一步，所述催化体系中，所述tpp的浓度为0.1-1.0mm，所述atp的浓度为0.5-5.0mm。
17、在某些实施方式中，所述催化体系中还添加有1-50mm的mgcl2。
18、在某些实施方式中，所述催化反应的时间为1-5h，所述催化反应的温度为15-50℃，所述催化反应的ph为5-8.5。
19、本发明提供的第二个技术方案为磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd在催化合成胞苷酸的应用，所述磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd源于卡斯特兰尼氏菌(castellanielladefragrans)，所述磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd的氨基酸序列如seq id no:4。
20、在某些实施方式中，所述磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd的制备方法包括如下步骤：
21、(1)以大肠杆菌为宿主细胞，过表达来源于卡斯特兰尼氏菌(castellanielladefragrans)的磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd，获得基因工程菌；
22、(2)培养步骤(1)中的基因工程菌，并诱导其表达磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd后，破碎菌体，获得含有磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd的粗酶液。
23、在某些实施方式中，所述基因工程菌在lb液体培养基中，于37℃，220rpm培养至od600＝0.6-0.8，添加0.2～1.0mm的iptg，于28℃，220rpm诱导24h，8000×g离心去上清，用ph 7.5，50mmol/l tris-hcl缓冲液复溶菌体，超声破碎，8000×g离心收集上清得到粗酶液。
24、本发明提供的第三个技术方案为第一个技术方案所述的方法在制备5’-胞苷酸或含有5’-胞苷酸产品中的应用。
25、本发明提供的第四个技术方案为第一个技术方案所述的方法在医药、食品领域中的应用。
26、有益效果
27、本发明采用多酶一锅法催化技术，以甲醛、磷酸盐、胞苷为原料，通过3个酶(磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd、乙酸激酶ack、尿苷胞苷激酶udk)的协同作用，实现了高浓度底物胞苷(50g/l)的高效转化，底物可以被完全转化，获得了5’cmp的高效生产，5’cmp滴度最高可达58.8g/l，工艺简单，促进其在医药等领域中的应用。
1.一种生产胞苷酸的方法，其特征在于，所述方法以甲醛、磷酸盐、胞苷为底物，利用磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd、乙酸激酶ack、尿苷胞苷激酶udk作为催化剂组成催化体系，催化合成5’-胞苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd来源于卡斯特兰尼氏菌(castellaniella defragrans)，所述磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd的氨基酸序列如seq id no:4；
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述催化体系中，所述磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd的酶蛋白的添加量为1-50mg/ml；所述乙酸激酶ack的酶蛋白的添加量为1-50mg/ml；所述尿苷胞苷激酶udk的酶蛋白的添加量为1-50mg/ml。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述乙酸激酶ack通过连接肽连接所述磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd组成融合蛋白ack-sa；可选地，所述连接肽为sggsgs、dessaqg、akaaea或aegege；可选地，在所述催化体系中，融合蛋白ack-sa的酶蛋白添加量为1-50mg/ml。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述催化体系中，所述胞苷的浓度为30～70g/l；所述甲醛的浓度为0.2～0.6m；所述磷酸盐的浓度为0.2～0.6m。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述催化体系还包含有焦磷酸硫胺素、atp和mgcl2。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述催化反应的时间为1-5h，所述催化反应的温度为15-50℃，所述催化反应的ph为5-8.5。
8.磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd在催化合成胞苷酸的应用，其特征在于，所述磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd源于卡斯特兰尼氏菌(castellaniella defragrans)，所述磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd的氨基酸序列如seq id no:4。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述磺基乙醛乙酰转移酶sa_cd的制备方法包括如下步骤：
10.权利要求1～7任一项所述的方法在制备5’-胞苷酸或含有5’-胞苷酸产品中的应用。
