本发明涉及生物检测，特别是涉及用于鉴定火烈鸟性别的raa-pfago组合物、试剂盒及应用。
背景技术：
1、火烈鸟(phoenicopteridae)属于红鹳科鸟类，多分布于美洲、欧洲等地。火烈鸟属于单态性鸟，即人们无法单一从外观判断其性别，在动物园中，若能快速准确地判断出火烈鸟的性别，有利于饲养人员提前做好饲养管理、繁殖育种与疫病防治规划。鸟类传统的性别鉴定方法有翻肛法和内窥镜法，但这两种方法对鸟类伤害较大，不适用于火烈鸟等珍稀鸟类。目前，pcr等分子鉴定技术已为火烈鸟性别鉴定提供了工具，但是pcr方法设备要求较高，耗时长，不便于野外现场操作，该方法难以普及于一般动物园或饲养场。
技术实现思路
1、针对上述问题，本发明提供了一种用于鉴定火烈鸟性别的raa-pfago组合物，利用该raa-pfago组合物能够对雌性火烈鸟检测到扩增信号，而雄性火烈鸟无扩增信号，进而对火烈鸟的性别进行判别，以此raa-pfago组合物为基础对火烈鸟进行性别鉴定，整个反应不需要复杂的仪器，效率高、特异性好、灵敏度高、检测时间短、无创检测，更适用于现场检测。
2、本发明提供了一种用于鉴定火烈鸟性别的raa-pfago组合物，包括raa引物对、guide dna、探针；所述raa引物对如seq id no.9、seq id no.10所示，所述guide dna如seqid no.11所示，所述探针的序列如seq id no.17所示。
3、重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase-aided amplification，raa)是一种恒温扩增技术，其反应过程包括重组酶结合、链置换和延伸三个阶段，在37～42℃条件下，反应20～30min即可完成指数增长达到检测水平，适用于基因快速扩增。pfago蛋白是一类存在于原核生物体内的蛋白，其在5’磷酸化guide dna引导下可靶向切割单链或双链dna，现多用于分子检测。raa-pfago系统多用于病毒、细菌和寄生虫等检测，但尚未见用于火烈鸟性别鉴定的报道。基于此，本发明人根据雌性火烈鸟w染色体和雄性z染色体的chd基因序列差异，提出上述raa-pfago组合物，利用该raa-pfago组合物能够对雌性火烈鸟检测到扩增信号，而雄性火烈鸟无扩增信号，进而对火烈鸟的性别进行判别，将上述raa-pfago组合物结合raa-pfago技术建立的快速准确、便捷无创的火烈鸟性别鉴别方法，不需要复杂的仪器，效率高、特异性好、灵敏度高、检测时间短、无创检测，更适用于现场检测。
4、本发明还提供了一种用于鉴定火烈鸟性别的检测体系，包括raa扩增反应体系、pfago检测反应体系，所述raa扩增反应体系包括权利要求1所述的raa引物对，所述pfago检测反应体系包括所述guide dna、探针。
5、在其中一个实施例中，所述pfago检测反应体系还包括pfago蛋白。
6、在其中一个实施例中，所述探针的5’端连接荧光基团，所述探针的3’端连接淬灭基团。
7、在其中一个实施例中，所述guide dna的5’端连接磷酸基团。
8、在其中一个实施例中，所述raa扩增反应体系的反应条件包括：孵育温度为37-42℃，孵育时间为20-30min；所述pfago检测反应体系的反应条件包括：反应温度为95-98℃，反应时间为20-30min。
9、在其中一个实施例中，所述raa引物对的工作浓度为0.3-0.5μm。
10、所述工作浓度为上述raa引物对在使用时能够达到预期效果的浓度，可以理解的，本领域技术人员在配制含有上述raa引物对的试剂时，可以配制浓度更高的母液或者储备液，待使用时再稀释，所述母液或者储备液及其浓度均在本发明的保护范围之内。
11、本发明还提供了一种用于鉴定火烈鸟性别的试剂盒，包括所述raa-pfago组合物，或包括所述检测体系。
12、在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括阴性对照品。
13、本发明还提供了一种火烈鸟性别鉴定的方法，包括以下步骤：提取待测样本的核酸，采用所述试剂盒进行检测。
14、上述方法最低检测限是0.6ng，全程在1个小时内可以快速方便无创鉴定出火烈鸟的性别，整个反应不需要复杂的仪器。上述火烈鸟性别鉴定的方法，具有效率高、特异性好、灵敏度高、检测时间短、无创，更适用于现场检测的优点。
15、在其中一个实施例中，所述待测样本包括羽毛。
16、本发明还提供了所述raa-pfago组合物或所述的检测体系在制备用于鉴定火烈鸟性别产品中的应用。
17、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
18、本发明的一种用于鉴定火烈鸟性别的raa-pfago组合物，利用该raa-pfago组合物能够对雌性火烈鸟检测到扩增信号，而雄性火烈鸟无扩增信号，进而对火烈鸟的性别进行判别。以此raa-pfago组合物为基础对火烈鸟进行性别鉴定的方法，整个反应不需要复杂的仪器，效率高、特异性好、灵敏度高、检测时间短、无创检测，更适用于现场检测。
1.一种用于鉴定火烈鸟性别的raa-pfago组合物，其特征在于，包括raa引物对、guidedna、探针；所述raa引物对如seq id no.9、seq id no.10所示，所述guide dna如seq idno.13所示，所述探针的序列如seq id no.19所示。
2.一种用于鉴定火烈鸟性别的检测体系，其特征在于，包括raa扩增反应体系、pfago检测反应体系，所述raa扩增反应体系包括权利要求1所述的raa引物对，所述pfago检测反应体系包括权利要求1所述的guide dna、探针。
3.根据权利要求2所述的检测体系，其特征在于，所述pfago检测反应体系还包括pfago蛋白。
4.根据权利要求3所述的检测体系，其特征在于，所述探针的5’端连接荧光基团，所述探针的3’端连接淬灭基团。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的检测体系，其特征在于，所述guide dna的5’端连接磷酸基团。
6.根据权利要求5所述的检测体系，其特征在于，所述raa扩增反应体系的反应条件包括：孵育温度为37-42℃，孵育时间为20-30min；所述pfago检测反应体系的反应条件包括：反应温度为95-98℃，反应时间为20-30min。
7.一种用于鉴定火烈鸟性别的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的raa-pfago组合物，或包括权利要求2-6中任一项所述的检测体系。
8.一种火烈鸟性别鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样本的核酸，采用权利要求7所述试剂盒进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括羽毛。
10.权利要求1所述raa-pfago组合物或权利要求2-6中任一项所述的检测体系在制备用于鉴定火烈鸟性别产品中的应用。
