本发明涉及细胞生物成像，特别是涉及一种用于荧光蛋白筛选的自动化成像装置和方法。
背景技术：
1、荧光蛋白标记是细胞生物学研究中的一种重要工具，尤其在活细胞成像和分子生物学研究中具有广泛应用。荧光蛋白和小分子探针的独特光化学性质，使得它们能够在特定波长的光照下发出荧光，从而标记和观察活细胞内的动态过程。目前，对于荧光蛋白应用于双光子成像的研究非常少，更鲜有针对双光子成像开发的荧光蛋白探针。同时，目前功能成像探针缺乏，功能研究只有gcamp系列，一般位于神经元胞体，胞体探针信号一般比定位在特殊结构或者细胞器上的探针的信号弱。此外，由于gcamp的双光子激发波长峰值在920nm附近，不能与双光子激光器的最高能量频段800nm匹配，因而限制了信号强度的提高。
2、基于上述问题，需要开发具有更高信噪比和分辨率的新型荧光蛋白探针，特别是针对双光子成像优化设计的探针，以满足高精度、高分辨率的细胞生物学研究需求。通过优化荧光蛋白的光谱特性，提升其在双光子成像中的激发效率和发光强度，将显著提高功能成像的质量和效率，为神经科学和其他生命科学领域的研究提供更强大的工具。
3、现阶段荧光探针的筛选主要有两种方式：
4、一是使用流式细胞仪进行筛选的方式，该方式一般用于直接探测荧光探针发射光强的情况。表达荧光蛋白的单细胞生物样品通过系统探测相应波段的发射光光强，根据设定的阈值分离和收集符合条件的样品，因而这种方式能实现多通道筛选，获得极高的通量。但是，目前商业化的流式细胞仪都没有配备双光子激光器，且由于样品在流式系统中不断运动，即使有双光子激光器也不能保证两个光子照射在样品的同一位置，因此不适用于双光子荧光探针的筛选。
5、二是对培养皿中的菌落进行扫描筛选，该方式是先将突变的荧光蛋白质粒转化到大肠杆菌(e.coli)内，在培养皿里培养直至荧光蛋白成熟；再根据需要筛选的荧光蛋白特性，选择合适的光源、滤光片组并设置筛选程序，将培养皿置于可移动位移台执行程序，同时记录每个单克隆发出的荧光信号，通过位移台移动扫描整个培养皿；最后将每次探测的光强等信息进行汇总，分析、筛选所需的突变。2015年，aleksander rebane实验室用上述策略对egfp的双光子性质定向进化。扫描筛选方式存在诸多局限性，主要体现在：1.扫描全培养皿时每皿大约需要20分钟，占空比低，效率低下；2.单光子成像和双光子扫描之间存在时间差，可能导致荧光蛋白增值；3.单光子图像记录的是所有层的宽场图像，而双光子光斑聚焦厚度一般为微米量级，记录的不是相同层面，单、双光子亮度的参考不准确；4.以egfp为模板的结构探针不能直接用于功能监测。
6、总之，功能探针的缺乏和仪器设备的限制，是当前荧光蛋白标记技术在双光子成像应用中的主要挑战。缺乏高通量双光子荧光探针筛选系统是导致功能探针匮乏的关键原因之一。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种用于荧光蛋白筛选的自动化成像装置和方法，其能够准确进行数据测量、记录和处理，为高精度、高分辨率的细胞生物学研究提供有力支持。
2、为实现上述目的，本发明提供一种用于荧光蛋白筛选的自动化成像装置，其包括菌落定位单元、移动控制单元和激光点扫描单元，其中：
3、移动控制单元包括电动位移台，用于放置装有菌落样本的培养皿，根据运动控制信号，将培养皿内每个菌落依次移动到激光点扫描单元的视场中央；
4、菌落定位单元用于对培养皿内的所有菌落进行全景定位，根据培养皿的尺寸选择成像方式，通过明场进行成像，获得菌落图像，进而获取每一个菌落在菌落图像的位置，依靠标定的映射关系，获取电动位移台的运动控制信号；
5、激光点扫描单元用于对每个定位后的菌落进行点扫描荧光成像，获得当前激光波长下的整个培养皿内菌落的荧光图像；其中，激光波长为在预对焦好后依据荧光蛋白筛选任务选择得到。
6、进一步地，所述用于荧光蛋白筛选的自动化成像装置还包括荧光亮度统计分析单元，用于根据菌落的荧光图像，统计计算每个菌落的双光子荧光亮度，统计排序后筛选出目标菌落。
7、进一步地，根据培养皿的尺寸选择成像方式包括如下两种：
8、第一种，若培养皿的尺寸小于或等于菌落定位单元的单视野视场，则采用单视野成像方式；
9、第二种，若培养皿的尺寸大于菌落定位单元的单视野视场，则进行多视场拼接成像方式。
10、进一步地，激光点扫描单元为正置，包括荧光探测光路、双光子激光模块、单光子激光模块、第一二向色镜、第一反射镜、第一中继透镜、第二中继透镜、第二反射镜、双轴振镜和扫描透镜；其中：
11、单光子激光模块产生的单光子光束，经过第一二向色镜反射后，与双光子激光模块产生的双光子光束重合，得到单/双光子光束，单/双光子光束经过第一反射镜，由第一中继透镜和第二中继透镜扩束后，再经第二反射镜反射，入射到双轴振镜，经过双轴振镜后，通过扫描透镜，进入荧光探测光路中，荧光探测光路用于将进入的单/双光子光束形成逐点的激发扫描光，照射位于激光点扫描单元的视场中央的菌落，以及记录菌落发出的特定波长范围的荧光信号，获得菌落的荧光图像。
12、进一步地，双光子激光模块包括双光子激光器、飞秒脉冲压缩器和电光调制器，飞秒脉冲压缩器用于补偿双光子激光脉冲通过光学元件所引起的脉冲展宽，电光调制器用于快速调制飞秒脉冲双光子激光。
13、进一步地，荧光探测光路包括第二二向色镜、管镜、物镜、滤光片和相机，其中，通过扫描透镜的单/双光子光束经由第二二向色镜反射到管镜(32)，随后入射到物镜，形成逐点的激发扫描光，菌落受激发后发出的荧光通过滤光片滤光，被相机采集；该扫描激发过程中，相机一直处于曝光状态，在双轴振镜完成一行点扫描成像后，双轴振镜的电压设置为最大值，电光调制器的电压使双光子光束的光强调节为最小值。
14、本发明还提供一种用于荧光蛋白筛选的自动化成像方法，其包括：
15、步骤1，将装有菌落样本的培养皿放置在电动位移台上，通过菌落定位单元对培养皿内的所有菌落进行全景定位；
16、步骤2，根据培养皿的尺寸选择成像方式，利用菌落定位单元提供的明场进行成像，获得菌落图像；
17、步骤3，根据步骤2获得的菌落图像，获取每一个菌落在菌落图像的位置，依靠标定的映射关系，获取电动位移台的运动控制信号，根据运动控制信号控制电动位移台将培养皿内每个菌落依次移动到激光点扫描单元的视场中央；
18、步骤4，在预对焦好后依据一荧光蛋白筛选任务选择一激光波长；
19、步骤5，通过激光点扫描单元对每个定位后的菌落进行点扫描荧光成像，获得当前激光波长下的整个培养皿内菌落的荧光图像；
20、步骤6，依据另一荧光蛋白筛选任务选择一激光波长，并返回步骤5，直至完成所有的荧光蛋白筛选任务。
21、进一步地，步骤2中，根据培养皿的尺寸选择成像方式包括如下两种：
22、第一种，若培养皿的尺寸小于或等于菌落定位单元的单视野视场，则采用单视野成像方式；
23、第二种，若培养皿的尺寸大于菌落定位单元的单视野视场，则进行多视场拼接成像成像方式。
24、进一步地，步骤5中的点扫描采用如下任一种对焦方式：
25、a.平面拟合：首先选择多个菌落位置进行对焦搜索最佳焦面，对培养皿内的菌落分布做三维平面拟合，再根据平面拟合结果控制电动位移台高度，对焦余下的所有菌落；
26、b.逐层拍摄：对所有菌落进行多层拍摄，层数和层间距预先设定；
27、c.固定轴向：对所有菌落进行单层拍摄；
28、d.5层拍摄：对所有菌落进行5层拍摄，层间距预先设定。
29、进一步地，激光点扫描单元为正置，包括荧光探测光路、双光子激光模块、单光子激光模块、第一二向色镜、第一反射镜、第一中继透镜、第二中继透镜、第二反射镜、双轴振镜和扫描透镜；其中：
30、单光子激光模块产生的单光子光束，经过第一二向色镜反射后，与双光子激光模块产生的双光子光束重合，得到单/双光子光束，单/双光子光束经过第一反射镜，由第一中继透镜和第二中继透镜扩束后，再经第二反射镜反射，入射到双轴振镜，经过双轴振镜后，通过扫描透镜，进入荧光探测光路中，荧光探测光路用于将进入的单/双光子光束形成逐点的激发扫描光，照射位于激光点扫描单元的视场中央的菌落，同时，记录菌落发出的特定波长范围的荧光信号，获得菌落的荧光图像；
31、双光子激光模块包括双光子激光器、飞秒脉冲压缩器和电光调制器，飞秒脉冲压缩器用于补偿双光子激光脉冲通过光学元件所引起的脉冲展宽，电光调制器用于快速调制飞秒脉冲双光子激光；
32、荧光探测光路包括第二二向色镜、管镜、物镜、滤光片和相机，其中，通过扫描透镜的单/双光子光束经由第二二向色镜反射到管镜，随后入射到物镜，形成逐点的激发扫描光，菌落受激发后发出的荧光通过滤光片滤光，被相机采集；该扫描激发过程中，相机一直处于曝光状态，在双轴振镜完成一行点扫描成像后，双轴振镜的电压设置为最大值，电光调制器的电压使双光子光束的光强调节为最小值。
33、本发明由于采取以上技术方案，具有以下优点：
34、1.高通量筛选能力：通过菌落定位单元，实现对大批量菌落的快速识别和定位，提高了筛选效率。结合自动化成像和电动位移台的精确移动控制，能够在短时间内完成大规模菌落的筛选任务，极大地提升了筛选的通量和效率。
35、2.本发明通过集成大视场成像、单/双光子点扫描成像和自动化数据处理技术，显著提升了荧光蛋白筛选的效率和质量。研究人员可以更加高效地筛选出性能优异的荧光蛋白，加速新型探针的开发进程，推动细胞生物学和神经科学等领域的研究进展。
36、3.自动化分析与数据处理：荧光亮度统计分析单元能够对获取的双光子荧光图像进行自动化处理和分析，快速统计计算每个菌落的双光子荧光亮度。该系统具备高效的数据处理能力，能够准确提供每个菌落的荧光强度信息，为筛选提供可靠的数据支持。
1.一种用于荧光蛋白筛选的自动化成像装置，其特征在于，包括菌落定位单元(1)、移动控制单元(2)和激光点扫描单元(3)，其中：
2.如权利要求1所述的用于荧光蛋白筛选的自动化成像装置，其特征在于，还包括荧光亮度统计分析单元，用于根据菌落的荧光图像，统计计算每个菌落的双光子荧光亮度，统计排序后筛选出目标菌落。
3.如权利要求1或2所述的用于荧光蛋白筛选的自动化成像装置，其特征在于，根据培养皿(22)的尺寸选择成像方式包括如下两种：
4.如权利要求3所述的用于荧光蛋白筛选的自动化成像装置，其特征在于，激光点扫描单元(3)为正置，包括荧光探测光路(3a)、双光子激光模块(3b)、单光子激光模块(316)、第一二向色镜(312)、第一反射镜(311)、第一中继透镜(310)、第二中继透镜(39)、第二反射镜(38)、双轴振镜(37)和扫描透镜(36)；其中：
5.如权利要求4所述的用于荧光蛋白筛选的自动化成像装置，其特征在于，双光子激光模块(3b)包括双光子激光器(315)、飞秒脉冲压缩器(314)和电光调制器(313)，飞秒脉冲压缩器(314)用于补偿双光子激光脉冲通过光学元件所引起的脉冲展宽，电光调制器(313)用于快速调制飞秒脉冲双光子激光。
6.如权利要求5所述的用于荧光蛋白筛选的自动化成像装置，其特征在于，荧光探测光路(3a)包括第二二向色镜(33)、管镜(32)、物镜(31)、滤光片(34)和相机(35)，其中，通过扫描透镜(36)的单/双光子光束经由第二二向色镜(33)反射到管镜(32)，随后入射到物镜(31)，形成逐点的激发扫描光，菌落受激发后发出的荧光通过滤光片(34)滤光，被相机(35)采集；该扫描激发过程中，相机(35)一直处于曝光状态，在双轴振镜(37)完成一行点扫描成像后，双轴振镜(37)的电压设置为最大值，电光调制器(313)的电压使双光子光束的光强调节为最小值。
7.一种用于荧光蛋白筛选的自动化成像方法，其特征在于，包括：
8.如权利要求7所述的用于荧光蛋白筛选的自动化成像方法，其特征在于，步骤2中，根据培养皿(22)的尺寸选择成像方式包括如下两种：
9.如权利要求7所述的用于荧光蛋白筛选的自动化成像方法，其特征在于，步骤5中的点扫描采用如下任一种对焦方式：
10.如权利要求7-9中任一项所述的用于荧光蛋白筛选的自动化成像方法，其特征在于，激光点扫描单元(3)为正置，包括荧光探测光路(3a)、双光子激光模块(3b)、单光子激光模块(316)、第一二向色镜(312)、第一反射镜(311)、第一中继透镜(310)、第二中继透镜(39)、第二反射镜(38)、双轴振镜(37)和扫描透镜(36)；其中：
