本发明涉及分子诊断，具体提供一种基于血浆外泌体mirnas联合检测dlbcl的诊断试剂盒。
背景技术：
1、弥漫大b细胞淋巴瘤(diffuse large b-cell lymphoma，dlbcl)是成人最常见的淋巴恶性肿瘤，占成人非霍奇金淋巴瘤的30-40%。dlbcl诊断的“金标准”为侵入性的淋巴结活检，该方法重复取样受限且无法动态监测肿瘤的变化。目前，临床上常根据国际预后指数（international prognostic index, ipi）预测患者的预后，ipi基于患者年龄、乳酸脱氢酶（ldh）水平、ecog评分、病理分期以及淋巴结外累计部位数量等参数对患者进行预后分类。然而，依然有部分患者虽预后指数良好，仍会出现预后较差。约75-80%的患者可通过r-chop方案（利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松）治疗实现完全缓解，但仍有40%的患者会出现复发或原发难治性的疾病。所以，临床亟需一种操作简单、特异性强的分子来提前发现疾病并表征疾病的进展及预后。
2、外泌体（exosomes）是由脂质双分子膜包裹的平均直径为100nm（30-150nm）的囊泡结构。外泌体几乎存在于所有体液中。外泌体可以携带来自不同组织和细胞的各种大分子，包括mrna、microrna（mirna）、dna、蛋白质等生物分子，参与抗原提呈，细胞分化、生长，肿瘤免疫应答，肿瘤细胞迁移和侵袭等过程，与疾病的发生和发展密切相关。
3、mirnas是一类长度为19-24个核苷酸的单链非编码rna。mirnas通过与靶mrna的3’-utr结合,在转录后水平的基因表达调控中发挥作用。通过该机制，mirnas可以调控已知的超过50%的人类基因，涉及癌症的10个主要途径。并且mirnas还参与了许多生物过程，包括细胞增殖和凋亡。
4、现有技术中，还未有联合多种mirnas与弥漫大b细胞淋巴瘤病情早期诊断或复发监测的相关性研究。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的缺陷，本发明采集患者和健康人群的外周血，筛选并验证表达差异性血浆外泌体mirnas，作为弥漫大b细胞淋巴瘤的诊断标志物，形成具有无创、重复性强、可实时监测等优点的dlbcl诊断试剂盒，本发明所提供的诊断标志物可用在dlbcl的早期诊断、基因分型、复发监测及疗效评价中。
2、具体地，本发明第一方面提供弥漫大b细胞淋巴瘤的诊断标志物，所述诊断标志物为外周血外泌体mirnas，所述外周血外泌体mirnas为has-let-7c-5p和has-mir-7704；或所述外周血外泌体mirnas为has-mir-451a、has-let-7c-5p和has-mir-7704；或所述外周血外泌体mirnas为has-let-7c-5p、has-mir-7704和has-mir-30c-5p；或所述外周血外泌体mirnas为has-mir-451a、has-let-7c-5p、has-mir-7704和has-mir-30c-5p
3、第二方面，本发明提供一种引物组合，所述引物组合为检测上述诊断标志物的引物。
4、本发明提供的引物组合的序列包括：seq id no.1-4和seq id no.8，其中，seq idno.8为通用反向引物。
5、其中，检测has-mir-451a表达水平的rt-pcr正向引物为:tcggcaggaaaccgttaccattac；
6、用于检测血浆外泌体has-let-7c-5p表达水平的rt-pcr正向引物为：
7、gccgagtgaggtagtaggttgt；
8、用于检测血浆外泌体has-mir-7704表达水平的rt-pcr正向引物为：gccgagcggggtcggcggc；
9、用于检测血浆外泌体has-mir-30c-5p表达水平的rt-pcr正向引物为：
10、gccgagtgtaaacatcctacact。
11、用于检测血浆外泌体外参基因cel-mir-39表达水平的rt-pcr正向引物为：agcccgtcacctggtgtaaatc；
12、通用反向引物为：cagtgcagggtccgaggtat。
13、优选地，本发明提供的引物组合的序列为：seq id no.2-3和seq id no.8；或seqid no.1-3和seq id no.8；或seq id no.2-4和seq id no.8；或seq id no.1-4和seq idno.8。
14、根据本领域技术人员的理解，第三方面，本发明还提供了上述的诊断标志物或上述的引物组合在制备弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品中的应用。
15、在本发明所提供的应用中，所述弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品包括：弥漫大b细胞淋巴瘤诊断芯片、弥漫大b细胞淋巴瘤诊断试剂和弥漫大b细胞淋巴瘤诊断试剂盒。
16、第四方面，本发明提供弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品，所述弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品中，含有检测外周血外泌体has-mir-451a、has-let-7c-5p、has-mir-7704和/或has-mir-30c-5p表达水平的引物对。
17、优选地，本发明提供弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品，所述弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品中，含有检测外周血外泌体has-let-7c-5p和has-mir-7704表达水平的引物对。
18、或含有检测外周血外泌体has-mir-451a、has-let-7c-5p和has-mir-7704和表达水平的引物对。
19、或含有检测外周血外泌体has-let-7c-5p和has-mir-7704和has-mir-30c-5p表达水平的引物对。
20、本发明提供的弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品为血液试剂盒，所述血液试剂盒中含有上述引物组合所示序列。
21、本发明提供的弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品为血液试剂盒时，所述血液试剂盒中还含有seq id no.9-12所示序列。
22、第五方面，本发明提供上述的诊断标志物或上述的引物组合或上述的弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品在弥漫大b细胞淋巴瘤基因分型、复发监测或疗效评价中的应用，所述应用为非疾病诊断及诊断目的。
23、本发明的有益效果在于：
24、发明人通过转录组测序分析dlbcl患者与健康对照（health control, hc）的差异性表达血浆外泌体mirnas，通过实时荧光定量pcr（rt-qpcr）方法对血浆外泌体mirnas进行定量验证后，获得可以作为dlbcl患者非侵入性新型诊断生物标记物。
25、本发明所提供四组联合诊断标记物（has-let-7c-5p和has-mir-7704；或has-mir-451a、has-let-7c-5p和has-mir-7704；或has-let-7c-5p、has-mir-7704和has-mir-30c-5p；或has-mir-451a、has-let-7c-5p、has-mir-7704和has-mir-30c-5p）在dlbcl的早期诊断、基因分型、复发监测及疗效评价中均有重要意义。且相对于其他非侵入性的生物标记物，外泌体mirnas有脂质双分子层包裹，因此更稳定。
1.弥漫大b细胞淋巴瘤的诊断标志物，其特征在于，所述诊断标志物为外周血外泌体mirnas，所述外周血外泌体mirnas为has-let-7c-5p和has-mir-7704；或所述外周血外泌体mirnas为has-mir-451a、has-let-7c-5p和has-mir-7704；或所述外周血外泌体mirnas为has-let-7c-5p、has-mir-7704和has-mir-30c-5p；或所述外周血外泌体mirnas为has-mir-451a、has-let-7c-5p、has-mir-7704和has-mir-30c-5p。
2.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合为检测权利要求1所述诊断标志物的引物。
3.根据权利要求2所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合的序列包括：seq idno.1-4和seq id no.8，其中，seq id no.8为通用反向引物。
4.根据权利要求3所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合的序列为seq id no.2-3和seq id no.8；或seq id no.1-3和seq id no.8；或seq id no.2-4和seq id no.8；或seq id no.1-4和seq id no.8。
5.权利要求1所述的诊断标志物或权利要求2-4任一项所述的引物组合在制备弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品包括：弥漫大b细胞淋巴瘤诊断芯片、弥漫大b细胞淋巴瘤诊断试剂和弥漫大b细胞淋巴瘤诊断试剂盒。
7.弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品，其特征在于，所述弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品中，含有检测外周血外泌体has-mir-451a、has-let-7c-5p、has-mir-7704和/或has-mir-30c-5p表达水平的引物对。
8.根据权利要求7所述的弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品，其特征在于，所述弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品为血液试剂盒，所述血液试剂盒中含有权利要求2-4任一项所述的引物组合。
9.根据权利要求7所述的弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品，其特征在于，所述弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品为血液试剂盒，所述血液试剂盒中还含有seq id no.9-12所示序列。
10.权利要求1所述的诊断标志物或权利要求2-4任一项所述的引物组合或权利要求7-9任一项所述的弥漫大b细胞淋巴瘤诊断产品在弥漫大b细胞淋巴瘤基因分型、复发监测或疗效评价中的应用，所述应用为非疾病诊断及诊断目的。
