本发明属于生物，涉及靶向尼帕病毒g蛋白的保护性单克隆抗体及其用途。
背景技术：
1、尼帕病毒(nipah virus，niv)是一种可感染人类和动物、具有高度传染性的单股、负链rna病毒，属于副粘病毒科亨尼帕病毒属(henipavirus，hnvs)。人类感染niv后，可导致无症状或轻度流感样疾病，重者可出现致死性呼吸道或神经系统疾病，病死率高达70％。niv主要有两个不同的毒株，分别是niv马来西亚株(niv-m)和niv孟加拉株(niv-b)。在过去的20年中，孟加拉国和印度几乎每年都有niv疫情的暴发，而近年来，hnvs的感染范围在不断扩大，除了之前发现的亨德拉病毒(hendravirus，hev)外，非洲、澳大利亚、亚洲和南美洲均有新病毒的发现，而我国新发现的mòjiāngvirus(mojv)和langyavirus(layv)也属于hnvs。目前还没有针对niv的批准疫苗或抗病毒治疗药物。
2、世界卫生组织和美国疾病预防控制中心已多次将niv列为需要高度优先关注的病原体，候选抗病毒药物的研发对具有潜在大流行风险的niv疫情的防控具有重要的价值。niv有两种膜锚定糖蛋白，即附着蛋白g和融合蛋白f，二者相互协同，介导病毒进入宿主细胞。niv的g蛋白和f蛋白位于病毒粒子表面，在niv的感染过程中发挥着重要作用，是诱导中和抗体产生的主要结构蛋白，也是开发niv疫苗的重要靶标。研究发现针对hev的f和g蛋白的抗体可以中和并抑制hev的感染，其中一些抗体还可以交叉识别niv。
3、目前虽有一些从hev感染康复者体内筛选到的针对g蛋白头部结构域的抗体，但是仍然缺乏针对hnvs的获批抗体药物。这暗示着仍然需要研发一批具有广谱中和活性的保护性抗体，为hnvs感染性疾病的防控提供新的候选药物和策略，为构建针对niv及其他hnvs的抗体鸡尾酒组合奠定基础。
技术实现思路
1、为了解决所述技术问题，本发明目的在于提供了两种靶向尼帕病毒g蛋白的保护性单克隆抗体及其用途，这两种抗体可以特异性识别尼帕病毒g蛋白的两个表位，具有很高的体外中和活性。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、在本发明的第一方面，提供了靶向尼帕病毒g蛋白的保护性单克隆抗体，所述两种靶向尼帕病毒g蛋白的保护性单克隆抗体或其抗原结合片段均包括重链可变区和轻链可变区，包括以下单克隆抗体中的一种：
4、单克隆抗体ln1f9或其抗原结合片段：能识别尼帕病毒和亨德拉病毒的g蛋白，其重链可变区具有如seq id no：1-seq id no：3所示的氨基酸序列的三个互补决定区；其轻链可变区具有如seq id no：6-seq id no：8所示的氨基酸序列的三个互补决定区；
5、单克隆抗体ln1d11或其抗原结合片段：能识别尼帕病毒的g蛋白，其重链可变区具有如seq id no：15-seq id no：17所示的氨基酸序列的三个互补决定区；其轻链可变区具有如seq id no：20-seq id no：22所示的氨基酸序列的三个互补决定区。
6、其中，上述seq id no：7的氨基酸序列为：nak。
7、上述seq id no：21的氨基酸序列为：yas。
8、进一步地，所述单克隆抗体ln1f9的所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no：4所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：9所示；
9、进一步地，所述单克隆抗体ln1d11的所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no：18所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：23所示。
10、进一步地，所述单克隆抗体ln1f9含有如seq id no：5所示的重链，和如seq idno：10所示的轻链。
11、进一步地，所述单克隆抗体ln1d11含有如seq id no：19所示的重链，和如seq idno：24所示的轻链。
12、进一步地，所述单克隆抗体还包括：
13、抗原结合片段相同的fab、fab’、fab’-sh、scfv、f(ab’)2；
14、或者所述单克隆抗体的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体，具有与所述重链可变区具有至少80％的同源性的氨基酸序列的重链可变区；和与所述轻链可变区具有至少80％的同源性的氨基酸序列的轻链可变区；
15、或者所述单克隆抗体的n端和/或c端连接标签得到的抗体；
16、或者所述单克隆抗体经过人源化改造得到的具有相同或相近功能的抗体。
17、在另外一些实施方案中，vh和/或vl氨基酸序列可以与上述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。具有与上述序列的vh和vl区高度(即80％或更高)同源的vh和vl区的抗体可以如下获得：诱变(例如定点诱变、pcr介导的诱变和ai介导的抗体改造)编码seq id no：1-10和15-24的核酸分子，然后用此处所述的功能试验检测编码的被改变抗体的保留的功能。
18、所述单克隆抗体包括：鼠抗体、人源化、双/三特异性抗体或嵌合抗体。
19、在其他实施方式中，可采用将可变区基因转化为scfv基因，一旦获得编码vh和vl片段的dna片段，即可通过标准重组dna技术进一步操作这些dna片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、fab片段基因或scfv基因。
20、在这些操作中，编码vl或vh的dna片段与编码另外一种蛋白质如抗体恒定区或柔性连接体的另一个dna片段有效连接。如本文使用的术语“有效连接”意思是两个dna片段连接在一起，使得这两个dna片段编码的氨基酸序列保持符合阅读框。
21、在本发明的第二方面，提供了一种含有所述的氨基酸序列的多肽。
22、进一步地，所述多肽，其含有选自seq id no：4、seq id no：5、seq id no：9、seqid no：10，seq id no：18、seq id no：19、seq id no：23、seq id no：24所示的氨基酸序列中的一种。
23、在本发明的第三方面，提供了一种编码所述单克隆抗体的核酸分子，所述核酸分子包括编码所述重链可变区的核酸分子和编码所述轻链可变区的核酸分子。
24、所述核酸分子编码前述任一单克隆抗体或其抗原结合片段或多肽，包括能够编码ln1f9抗体重链可变区(如seq id no：11)和/或轻链可变区(如seq id no：13)的序列，以及能够编码ln1f9抗体重链(如seq id no：12)和/或轻链(如seq id no：14)的序列。
25、包括能够编码ln1d11抗体重链可变区(如seq id no：25)和/或轻链可变区(如seqid no：27)的序列，以及能够编码ln1d11抗体重链(如seq id no：26)和/或轻链(如seq idno：28)的序列。
26、在本发明的第四方面，提供了一种包含所述核酸的表达载体，所述表达载体能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。
27、所述表达载体具体可以为但不局限于原核表达载体、噬菌体载体、病毒载体或哺乳动物表达载体，本发明具体采用哺乳动物表达载体。
28、在本发明的第五方面，提供了一种包含所述的表达载体的工程菌或真核宿主细胞。
29、在本发明的第六方面，提供了所述的靶向尼帕病毒g蛋白的保护性单克隆抗体或者所述的多肽或者所述的核酸分子或者所述的表达载体或者所述的工程菌或真核宿主细胞在制备用于预防和治疗尼帕病毒感染的药物或者用于检测尼帕病毒的试剂中的应用。
30、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
31、本发明提供的靶向尼帕病毒g蛋白的保护性单克隆抗体中，通过筛选小鼠的niv g特异结合的浆细胞，获得两株结合niv g蛋白的高中和活性单克隆抗体ln1f9和ln1d11；
32、所筛选到的单克隆抗体具有很高的体外中和活性，其中ln1f9对以vsv为骨架的niv-m假病毒的中和ic50可低至0.0719ng/ml，对vsv-niv-b假毒的中和ic50低至0.108ng/ml；其中ln1d11对以vsv为骨架的niv-m假病毒的中和ic50可低至0.657ng/ml，对vsv-niv-b假毒的中和ic50低至0.597ng/ml。本发明的两株niv g特异性单克隆抗体在临床治疗和预防niv和hev感染方面有比较高的应用价值。
1.两种靶向尼帕病毒g蛋白的保护性单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述两种靶向尼帕病毒g蛋白的保护性单克隆抗体或其抗原结合片段均包括重链可变区和轻链可变区，包括以下单克隆抗体中的一种：
2.根据权利要求1所述的一种靶向尼帕病毒g蛋白的保护性单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体ln1f9或其抗原结合片段的所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no：4所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：9所示；
3.根据权利要求1所述的靶向尼帕病毒g蛋白的保护性单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
4.根据权利要求1-3任一所述的靶向尼帕病毒g蛋白的保护性单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述单克隆抗体或其抗原结合片还包括：
5.一种含有如权利要求1-4任一所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的多肽。
6.一种编码权利要求1-4任一所述单克隆抗体的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码所述重链可变区的核酸分子和编码所述轻链可变区的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子包括以下中的至少一种：
8.一种包含权利要求6-7任一所述核酸分子的表达载体，其特征在于，所述表达载体能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。
9.一种包含权利要求8所述的表达载体的工程菌或真核宿主细胞。
10.权利要求1-4任一所述的靶向尼帕病毒g蛋白的保护性单克隆抗体或者权利要求5所述的多肽或者权利要求6-7任一所述的核酸分子或者权利要求8所述的表达载体或者权利要求9所述的工程菌或真核宿主细胞在制备用于预防和治疗尼帕或亨德拉病毒感染的药物或者用于检测尼帕和亨德拉等病毒的试剂中的应用。
